一种诺西那生钠原料药中残留苯甲酰胺的检测方法

本发明属于药物分析，尤其是涉及一种诺西那生钠原料药中残留苯甲酰胺的检测方法。

背景技术：

1、诺西那生钠注射液用于治疗脊髓性肌萎缩症，属于寡核苷酸药物。目前寡核苷酸药物暂无明确的质量标准要求，但仍可以参考ich(人用药品技术要求国际协调会议)、fda(食品药品监督管理局)等相关法规要求对其进行质量标准的制定，其中基因毒性杂质检测是需要重点关注的检测项目，因为基因毒性杂质在极低的浓度下就能对人体的dna造成损伤或突变，能对人体造成巨大的致癌风险，因此基因毒性杂质的检测是药物质量研究中必不可少的部分。首先对诺西那生钠原料药制备过程中使用的原料、试剂及产生的工艺副产物等进行初步评估，再利用基因毒性杂质预测软件对评估后的相关杂质进行预测，测试得出生产工艺中的副产物苯甲酰胺属于基因毒性杂质。

2、苯甲酰胺是核酸链上被保护基保护的碱基在氨解步骤脱保护过程中产生的，由于目前寡核苷酸药物合成的合成、使用的原料、物料及试剂等具有高度相似性，因此大部分合成的寡核苷酸药物会产生相同的苯甲酰胺杂质。然而，目前暂无关于寡核苷酸药物中苯甲酰胺的检测方法的报道。

3、因此，亟待开发一种检测诺西那生钠等寡核苷酸药物原料药中苯甲酰胺的方法，以用于检测寡核苷酸药物中苯甲酰胺的残留。

技术实现思路

1、本发明的目的就是为了填补对诺西那生钠原料药中苯甲酰胺的检测空白而提供一种诺西那生钠原料药中残留苯甲酰胺的检测方法。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

3、一种诺西那生钠原料药中残留苯甲酰胺的检测方法，包括以下步骤：

4、s1：配制苯甲酰胺储备溶液，并稀释为多个苯甲酰胺标准溶液；

5、s2：将s1中的苯甲酰胺标准溶液依次进样至高效液相色谱，得到苯甲酰胺标准溶液的液相色谱图，并绘制标准曲线；

6、s3：将诺西那生钠原料药进样至液相色谱，在相同色谱条件下得到诺西那生钠原料药的液相色谱图；

7、s4：配制苯甲酰胺对照品溶液并连续进样多针，获取苯甲酰胺的平均峰面积，通过计算确认s3中诺西那生钠原料药中的苯甲酰胺含量。

8、根据ich指导原则中的限度计算公式，诺西那生钠最大日剂量为12mg，pde为1.5μg/day，计算其限度1.5/12000为125ppm，适合选择高效液相色谱仪(hplc)检测。

9、本发明中，诺西那生钠原料药属于带电型极性的寡核苷酸化合物，结构式如式i所示。苯甲酰胺为中性小分子化合物，结构式如式ii所示。

10、

11、进一步地，步骤s1中，所述苯甲酰胺标准溶液的浓度范围为0.12～0.72μg/ml，标准溶液的个数为5-8个，以满足后续的标准曲线拟合条件。

12、进一步地，步骤s2中，所述高效液相色谱的进样量为5-10μl。

13、进一步地，步骤s2中，所述高效液相色谱的色谱柱为c18柱，检测波长为215-225nm。

14、进一步地，步骤s2中，所述高效液相色谱的流动相由乙酸铵溶液和甲醇组成，其中以浓度为5mmol/l的乙酸铵水溶液为流动相a，以甲醇溶为流动相b。

15、进一步地，所述流动相的流速为0.8-1.0ml/min。

16、进一步地，所述高效液相色谱的梯度洗脱程序为：

17、0～10min，a相由90％降至80％，b相由10％升至20％；

18、10～13min，a相保持在80％，b相保持在20％；

19、13～15min，a相由80％降至5％，b相由20％升至95％；

20、15～18min，a相保持在5％，b相保持在95％；

21、18～25min，a相由5％升至90％，b相由95％降至10％。

22、进一步地，步骤s2中，所述绘制标准曲线的具体过程为：从苯甲酰胺标准溶液的液相色谱图中获取峰面积信息，以苯甲酰胺标准溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，拟合得到标准曲线。

23、进一步地，步骤s4中，所述苯甲酰胺对照品溶液的浓度为0.6μg/ml并连续进针5-8次。

24、进一步地，步骤s4中，确认诺西那生钠原料药中苯甲酰胺含量的具体步骤为：从s3获得的诺西那生钠原料药液相色谱图中获取保留时间和峰面积信息，通过保留时间进行苯甲酰胺的定性确认，通过峰面积计算那生钠原料药中苯甲酰胺的含量。

25、进一步地，所述诺西那生钠原料药中的苯甲酰胺含量的计算参照以下公式：

26、

27、式中，ai为诺西那生钠原料药溶液中苯甲酰胺的峰面积；v为诺西那生钠原料药溶液的稀释体积，单位为ml；c为苯甲酰胺对照品溶液中相应苯甲酰胺的浓度，单位为g/ml；为对照品溶液中相应苯甲酰胺的平均峰面积；w为诺西那生钠原料药称样量，单位为g。

28、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

29、(1)本发明通过高效液相色谱实现了对诺西那生钠原料药中残留苯甲酰胺的检测与分析，填补了诺西那生钠等寡核苷酸药物原料药中苯甲酰胺的检测空白。

30、(2)本发明根据ich指导原则中的限度计算公式，诺西那生钠最大日剂量为12mg，pde为1.5μg/day，计算其限度1.5/12000为125ppm，适合选择高效液相色谱仪进行检测。

31、(3)本发明无需对样品进行复杂的前处理步骤，利用高效液相色谱进行检测，通过外标法准确检测诺西那生钠原料药中苯甲酰胺的浓度，灵敏度高，重复性好，准确度高，无需要再使用灵敏度更高的质谱仪器。

32、(4)本发明检测方法所用的色谱条件保证了色谱峰峰形良好，易于分辨，面积积分精度高，可推广应用于其他寡核苷酸药物中苯甲酰胺的检测。

33、(5)本发明的检测方法具有较好的统适用性和精密度，且测试结果具有良好的稳定性和可重复性，是一种准确、高效的检测方法。

技术特征：

1.一种诺西那生钠原料药中残留苯甲酰胺的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种诺西那生钠原料药中残留苯甲酰胺的检测方法，其特征在于，步骤s1中，所述苯甲酰胺标准溶液的浓度范围为0.12～0.72μg/ml，标准溶液的个数为5-8个。

3.根据权利要求1所述的一种诺西那生钠原料药中残留苯甲酰胺的检测方法，其特征在于，步骤s2中，所述高效液相色谱的进样量为5-10μl。

4.根据权利要求1所述的一种诺西那生钠原料药中残留苯甲酰胺的检测方法，其特征在于，步骤s2中，所述高效液相色谱的色谱柱为c18柱，检测波长为215-225nm。

5.根据权利要求1所述的一种诺西那生钠原料药中残留苯甲酰胺的检测方法，其特征在于，步骤s2中，所述高效液相色谱的流动相由乙酸铵溶液和甲醇组成，其中以浓度为5mmol/l的乙酸铵水溶液为流动相a，以甲醇为流动相b。

6.根据权利要求5所述的一种诺西那生钠原料药中残留苯甲酰胺的检测方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.8-1.0ml/min。

7.根据权利要求5所述的一种诺西那生钠原料药中残留苯甲酰胺的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱的梯度洗脱程序为：

8.根据权利要求1所述的一种诺西那生钠原料药中残留苯甲酰胺的检测方法，其特征在于，步骤s2中，所述绘制标准曲线的具体过程为：

9.根据权利要求1所述的一种诺西那生钠原料药中残留苯甲酰胺的检测方法，其特征在于，步骤s4中，确认诺西那生钠原料药中苯甲酰胺含量的具体步骤为：

10.根据权利要求9所述的一种诺西那生钠原料药中残留苯甲酰胺的检测方法，其特征在于，所述诺西那生钠原料药中的苯甲酰胺含量的计算参照以下公式：

技术总结本发明涉及一种诺西那生钠原料药中残留苯甲酰胺的检测方法，其包括以下步骤：S1：配制苯甲酰胺储备溶液，并稀释为多个苯甲酰胺标准溶液；S2：将S1中的苯甲酰胺标准溶液依次进样至高效液相色谱，得到苯甲酰胺标准溶液的液相色谱图，并绘制标准曲线；S3：将诺西那生钠原料药进样至液相色谱，在相同色谱条件下得到诺西那生钠原料药的液相色谱图；S4：配制苯甲酰胺对照品溶液并连续进样多针，获取苯甲酰胺的平均峰面积，通过计算确认S3中诺西那生钠原料药中的苯甲酰胺含量。与现有技术相比，本发明通过高效液相色谱实现了对诺西那生钠原料药中残留苯甲酰胺的检测与分析，灵敏度高，重复性好，准确度高。技术研发人员：吴晶晶,陈月新,李金亮,熊志刚,陈佳正受保护的技术使用者：上海应用技术大学技术研发日：技术公布日：2024/9/26