一种蛋白酶变体及其应用的制作方法

本公开涉及多肽合成，具体涉及一种来源于解淀粉芽孢杆菌蛋白酶的变体，以及该变体在催化肽段偶联和替尔泊肽的合成中的用途。

背景技术：

1、替尔泊肽是一种新型胰高血糖素样肽-1受体（glp-1）和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽（gip）双受体激动剂，于2022年5月经美国fda批准作为饮食和运动的辅助疗法，以改善成人2型糖尿病患者的血糖控制。替尔泊肽除对2型糖尿病和肥胖症疗效显著外，对非酒精性脂肪性肝炎也显示出一定的治疗潜力。

2、替尔泊肽由17种共39个氨基酸（包括37个编码氨基酸和2个非编码氨基酸）组成，含有一条c20脂肪二酸，其通过谷氨酸和2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酸二聚物，连接到侧链的赖氨酸残基上。已有报道采用固相合成/液相合成联合策略来合成替尔泊肽，先分别固相合成1-14aa、15-21aa、22-29 aa、30-39 aa四个片段，再通过液相合成的方式偶联获得替尔泊肽粗肽。

3、cn115991742a使用固相合成的方法连接各片段。虽免去液相对接的方法，但片段之间偶联时工艺控制难度较大、工艺较繁琐、粗肽纯度低的问题无法避免。

4、cn118005767a采用两片段法制备替尔泊肽，先制备得到全保护片段肽19-39，再制备全保护片段肽1-18，两者偶联得到全保护的替尔泊肽。

5、cn117106055a先通过固相法从c端到n端合成替尔泊肽主链肽，再脱除k20位点侧链保护基r1后依次偶联侧链各位点得到替尔泊肽粗肽。

6、固相合成肽链越长中间产生的小杂质越多，替尔泊肽有较多的疏水氨基酸，这些氨基酸在逐步偶联时产生较大的位阻，从而导致后续氨基酸偶联困难，尤其是phe22、val23、trp25、leu26四个氨基酸，影响纯化难度和收率。

7、化学侧链保护寡肽片段缩聚的主要缺点是，当酰基供体的c端氨基酸残基被激活时，会发生外消旋。相比之下，酶催化的肽偶联完全没有外消旋，并且在侧链官能团上没有副反应。酶介导多肽拼接法的应用是一种很有前景的策略，即催化肽酯（酰基供体）和肽胺（酰基受体）链段之间的连接。当使用工程蛋白酶时可能会发生水解副反应，包括酰基供体酯部分的水解和最终产物的非常缓慢的水解。因此，为了最大限度地提高产品收率，必须使这些副反应最小化。

8、因含有2个非编码氨基酸，生物合成替尔泊肽的难度增大，而酶介导多肽拼接法合成替尔泊肽方法未有报道。因此亟需一种生产成本较低，杂质少，纯化难度低，工艺简便，适于工业化生产的合成方法。

技术实现思路

1、为了解决以上至少一个问题，本公开提供了一种替尔泊肽的半合成方法。使用本公开所提供方法，能够减少氨基酸偶联难度，减少水解副反应和纯化难度，提高产品收率。

2、根据本公开的一个方面，提供了一种蛋白酶变体，所述蛋白酶变体具有提高的连接酶活性，且所述蛋白酶变体在第24位、第50位、第109位、第118位、第156位、第166位、第206位、第218位、第221位、第222位、第225位和第237位中的一个或者多个位点处具有氨基酸突变。

3、在一些实施方式中，本公开的蛋白酶变体能够催化肽c-端(硫)酯与具有n-端未保护的胺的肽亲核试剂进行偶联（即连接反应）。与具有如seq id no:3所示的氨基酸序列的野生型蛋白酶或者具有如seq id no:6所示的氨基酸序列的蛋白酶变体相比，本公开提供的蛋白酶变体具有提高的连接酶活性，和/或降低的水解酶活性。

4、在一些实施方式中，所述蛋白酶变体具有以下突变中的一种或多种：s24n、m50f、n109s、n118s、e156s、g166h、q206c、n218s、s221c、m222a、p225a和k237r。

5、在一些实施方式中，所述蛋白酶变体还可以包括第75~83位氨基酸的缺失（δ75-83）。

6、在一些实施方式中，所述蛋白酶变体还可以包括第76位氨基酸的突变。

7、在一些实施方式中，所述蛋白酶变体还可以包括突变n76d。

8、在一些实施方式中，所述蛋白酶变体还可以包括第213位氨基酸的突变。

9、在一些实施方式中，所述蛋白酶变体还可以包括突变k213r。

10、在一些实施方式中，所述蛋白酶变体具有s24n、m50f、δ75-83、n109s、n118s、e156s、g166h、q206c、n218s、s221c、m222a、p225a和k237r中的任意一种或多种氨基酸突变或缺失。在一些实施方式中，所述蛋白酶变体具有如seq id no: 4所示的氨基酸序列，或与其具有至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性的氨基酸序列。

11、在一些实施方式中，所述蛋白酶变体具有s24n、m50f、n76d、n109s、n118s、e156s、g166h、q206c、k213r、n218s、s221c、m222a、p225a和k237r中的任意一种或多种氨基酸突变。在一些实施方式中，所述蛋白酶变体具有如seq id no: 8所示的氨基酸序列，或与其具有至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性的氨基酸序列。

12、本公开的蛋白酶变体的氨基酸位点是参考seq id no:3所示的氨基酸序列定义的。

13、根据本公开的又一方面，提供了一种核酸分子，其编码本公开的上述蛋白酶变体。

14、根据本公开的又一方面，提供了一种表达载体，其包含本公开的上述核酸分子。

15、在一些实施方式中，所述表达载体包括原核表达载体和真核表达载体。

16、在一些实施方式中，所述真核表达载体包括酵母表达载体、哺乳动物表达载体、昆虫表达载体等。

17、根据本公开的又一方面，提供了一种宿主细胞，其包含本公开的上述核酸分子和/或表达载体。

18、在一些实施方式中，所述宿主细胞选自原核细胞和真核细胞。

19、在一些实施方式中，所述原核细胞包括细菌细胞。

20、在一些实施方式中，所述细菌包括大肠杆菌、链霉菌、枯草芽孢杆菌；

21、在一些实施方式中，所述真核细胞包括酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞等。

22、在一些实施方式中，所述哺乳动物选自人、猴、小鼠、大鼠、仓鼠、山羊、绵羊、牛、猪、犬或猫等。

23、在一些实施方式中，所述哺乳动物细胞包括cho细胞，chok1细胞、293细胞，vero细胞，bhk细胞，ns0细胞，sp2/0细胞，yo骨髓瘤细胞，p3x63小鼠骨髓瘤细胞，per细胞，per.c6细胞或杂交瘤细胞。

24、在一些实施方式中，所述细菌细胞包括b.subtilis rik1285细胞、wb600细胞、dh5α细胞、bl21细胞、dh10bac细胞、xl10-gold细胞、tg1细胞、stbl2细胞、bj5183细胞、hb101细胞或turbo细胞。

25、根据本公开的又一方面，提供了所述蛋白酶变体在催化(a)肽c-端(硫)酯与(b)具有n-端未保护的胺的肽亲核试剂偶联中的用途。

26、根据本公开的又一方面，提供了一种替尔泊肽的合成方法，所述方法包括：采用本公开的上述蛋白酶变体催化(a)肽c-端(硫)酯与(b)具有n-端未保护的胺的肽亲核试剂进行偶联的步骤。

27、在一些实施方式中，所述偶联在水性溶液中进行。

28、在一些实施方式中，所述具有n-端未保护的胺的肽亲核试剂包括替尔泊肽的第17~39位、第18~39位、第19~39位和/或第20~39位氨基酸，且第20位赖氨酸连接有c20-γ-glu-(aeea)2侧链。

29、在一些实施方式中，所述肽c-端(硫)酯包括替尔泊肽的第1~16位、第1~17位、第1~18位氨基酸和/或第1~19位氨基酸。

30、在一些实施方式中，所述n-端未保护的胺的肽亲核试剂具有序列h-ile-ala-gln-y-ala-phe-val-gln-trp-leu-ile-ala-gly-gly-pro-ser-ser-gly-asn-pro-pro-pro-ser，其中y是lys[-c20-γ-glu-(aeea)2]。

31、在一些实施方式中，所述肽c-端(硫)酯具有序列h-tyr-aib-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-ile-aib-leu-asp-lys-(硫)酯。

32、在一些实施方式中，所述偶联在ph 7~10下进行反应。

33、在一些实施方式中，所述偶联在ph 7、8、9或10下进行。

34、在一些实施方式中，所述肽c-端(硫)酯与所述具有n-端未保护的胺的肽亲核试剂的摩尔比为（1~100）：（1~100）。

35、在一些实施方式中，所述解淀粉芽孢杆菌蛋白酶变体、所述肽c-端(硫)酯与所述具有n-端未保护的胺的肽亲核试剂的摩尔比为（1~10）：（1~100）：（1~100）。

36、在一些实施方式中，所述具有n-端未保护的胺的肽亲核试剂通过以下步骤获得：1）通过生物合成的方式，合成包含替尔泊肽的第17~39位、第18~39位、第19~39位和/或第20~39位氨基酸的肽段；和，2）在lys残基上连接c20-γ-glu-(aeea)2侧链。

37、在一些实施方式中，所述步骤1）合成包含替尔泊肽的第17~39位氨基酸的肽段（氨基酸序列ile-ala-gln-lys-ala-phe-val-gln-trp-leu-ile-ala-gly-gly-pro-ser-ser-gly-asn-pro-pro-pro-ser，seq id no: 14）

38、在一些实施方式中，所述肽c-端(硫)酯通过固相合成法合成。

39、有益效果：

40、本公开所述提供的蛋白酶变体具有更强的连接酶活性和弱水解活性，稳定性好，连接效率高。

41、本公开所述方法采用半合成策略，使用蛋白酶变体催化肽段合成替尔泊肽。反应体系没有消旋作用，副反应小。一旦达到最适条件，这种合成系统应该容易地对肽进行大规模生产。

42、采用本公开所述方法制得的替尔泊肽纯度高，可达99％以上，工艺简单易于控制，综合成本低，大大减少合成废液的产生，非常适合工业化生产。