一种岷江百合查尔酮异构酶基因LrCHI1及应用

本发明涉及分子生物学以及基因工程相关，特别是一种具有提高植物抗真菌侵染能力的岷江百合查尔酮异构酶基因 lrchi1及应用。

背景技术：

1、植物在特定的生态环境中生长，其成长过程常常面临生物和非生物因素的挑战。生物胁迫，尤其是由病原真菌引起的病害，对植物生长和发育构成了重大威胁，这类病害在所有植物病害中占比高达70%至80% （gao f, guo hs. the battle and pathogenicintervention between plant and soilborne pathogens. chinese journal ofnature, 2020, 42(6): 499-504.）。目前，防治真菌病害主要依赖化学方法，即通过使用农药来控制病害的发生和扩散。然而，尽管化学防治能在短期内有效控制病害，但对于生长周期较长的作物，其效果并不理想。此外，农药残留还会影响农产品的质量和产量，且农药在土壤中的积累也对土壤健康造成了负面影响，这与农业的可持续发展目标背道而驰（高游慧, 郑泽慧, 张越, 等.根际微生态防治作物土传真菌病害的机制研究进展.中国农业大学学报, 2021, 26(6): 14.）。随着基因工程的不断进步，通过转基因技术培育抗病植物品种，增强植物自身的防御机制，如增加次级代谢物的合成，提供了一种克服化学防治局限的新途径。这种方法不仅可以减少对化学农药的依赖，降低农药残留的风险，还有助于保护良好的土壤健康，促进农业的长期可持续发展。

2、次级代谢物是植物为应对环境变化产生的重要物质。多有研究表明，萜烯类、生物碱类、黄酮类化合物在植物抗真菌病害的过程中具有重要作用（wu j, lv s, zhao l, etal. advances in the study of the function and mechanism of the action offlavonoids in plants under environmental stresses. planta, 2023, 257(6):108.）。黄酮类化合物可分为查尔酮、芪类、黄烷酮、黄酮、异黄酮、二氢黄酮醇、黄酮醇、花青素等12个亚类（zhuang wb, li yh, shu xc, et al. the classification, molecularstructure and biological biosynthesis of flavonoids, and their roles inbiotic and abiotic stresses. molecules, 2023, 28(8): 3599.）。其主要通过破坏质膜，引起线粒体功能障碍，抑制细胞壁形成、细胞分裂、rna及蛋白质合成、efflux介导的泵送系统，从而抑制真菌生长（chen s, wang x, cheng y, et al. a review ofclassification, biosynthesis, biological activities and potentialapplications of flavonoids. molecules, 2023 ,28(13): 4982.）。木犀草素处理后的樱桃（ cerasus pseudocerasus）对灰葡萄孢和扩展青霉的抗性提高（liu x, cui x, ji d,et al. luteolin-induced activation of the phenylpropanoid metabolic pathwaycontributes to quality maintenance and disease resistance of sweet cherry.food chemistry, 2021, 342: 128309.）。

3、查尔酮异构酶是第一个被认识的黄酮类化合物合成相关酶，也是黄酮代谢途径中的关键酶之一。查尔酮异构酶和查尔酮合酶一起构成了黄酮类化合物生物合成的限速酶（徐朝阳,张苛苛,王晨晨,等.生菜查尔酮异构酶基因克隆及体外酶活测定.植物生理学报,2023, 59(11):2135-2143.）。其通过催化柚皮素查尔酮发生分子内异构化形成柚皮素，继而转化形成各种类型的类黄酮化合物（ni r, zhu tt, zhang xs, et al.identification and evolutionary analysis of chalcone isomerase-fold proteinsin ferns. journal of experimental botany, 2020, 71(1): 290-304.）。在拟南芥（ amorphochlora amoebiformis）中过表达马缨杜鹃（ rhododendron delavayi） chi1后，其对氯化钠和甘露醇胁迫具有更高的抗性（孙威, 孙世宇, 陈一然, 等. 马缨杜鹃查尔酮异构酶基因rdchi1的克隆与功能解析.园艺学报, 2022, 49(11): 2407-2418）。在棉花（ gossypium barbadense）中沉默 chi01/05/06/09后，黄酮合成相关基因表达量下降、总黄酮含量降低、水杨酸及茉莉酸的含量减少、活性氧清除能力减弱，因而对尖孢镰刀菌（ fusarium oxysporum）更易感病（zu q, deng x, qu y, et al. geneticchannelization mechanism of four chalcone isomerase homologous genes forsynergistic resistance to fusariumwilt in gossypium barbadense l. internationaljournal of molecular sciences,  2023, 24(19): 14775.）。

4、百合为百合科（liliaceae）百合属（ lilium）多年生草本植物，具地下鳞茎，是世界知名的观赏花卉，也是重要的药食同源植物（zhou j, an r, huang x. genus lilium: areview on traditional uses, phytochemistry and pharmacology. journal ofethnopharmacology,  2023, 270: 113852.）。百合枯萎病，也称百合根腐病、茎腐病，是百合生产中严重的土传病害，己成为遏制百合产业发展的重要因素之一。岷江百合（ lilium  regale wilson）别名王百合、千叶百合，分布于我国四川岷江流域海拔760~2200 m气候变化剧烈的干旱河谷区域，其枯萎病具有高水平抗性，成为重要的育种亲本。研究岷江百合抗枯萎病的分子机理，对提高百合属植物的抗枯萎病性具有重要的意义（wang z, deng j,liang t, et al. lilium regalewilson wrky3 modulates an antimicrobial peptidegene, lrdef1, during response to fusarium oxysporum. bmc plant biology, 2022,24, 22(1): 257.）。

技术实现思路

1、本发明提供了一种岷江百合查尔酮异构酶基因 lrchi1及其在提高烟草对草茎点霉（ phoma herbarum）及茄链格孢（ alternaria solani）抗性中的应用。

2、本发明从岷江百合中克隆获得查尔酮异构酶基因 lrchi1， lrchi1核苷酸序列如seq id no:1所示，该基因cdna全长序列为977 bp，包含一个702 bp的开放阅读框、61 bp的5’非翻译区、214 bp的3’非翻译区，编码如seq id no:2所示氨基酸序列的蛋白质。

3、本发明中 lrchi1基因的编码区是序列表seq id no:1中第62-763位所示的核苷酸序列。

4、本发明分离克隆岷江百合的一个查尔酮异构酶基因 lrchi1的完整cdna片段，利用根癌农杆菌（ agrobacterium tumefaciens）介导将目的基因转入受体植物中并过表达，通过进一步实验验证该基因是否具有提高植物抗真菌的活性，为后期利用该基因改良烟草及其他植物抵御真菌病害的能力奠定基础，发明人将这个基因命名为 lrchi1。

5、上述 lrchi1基因可以应用于提高烟草的抗真菌特性，具体操作如下：

6、（1）采用扩增 lrchi1的特异引物，从岷江百合根中提取总rna，通过逆转录-聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，rt-pcr）扩增出 lrchi1的全长编码区，然后将其连接到pgem-t载体上，经测序获得具有目的基因的克隆；

7、（2）用限制性内切酶 ecori和 bamhi酶切pgem-t- lrchi1载体，通过胶回收得到目的基因片段，用同样的内切酶酶切植物表达载体pcambia2300s，胶回收获得所需载体大片段，再将所获得 lrchi1基因片段与pcambia2300s片段连接，构建植物超表达载体，之后将所构建的重组载体通过根癌农杆菌介导转入烟草中表达；

8、（3）以重组载体t-dna上具有的抗性标记筛选转化子，并通过pcr检测得到阳性转基因植株，分析转基因植物叶片抗真菌侵染的能力，最后筛选出对真菌抗性明显增强的转基因植株。

9、本发明通过基因工程手段培育抗病植物可以克服传统育种的不足，不仅育种周期缩短，而且操作简单，容易获得高抗材料。本发明来自岷江百合的 lrchi1基因能增强植物对真菌的抗性，将该基因导入烟草中，可以产生具有真菌抗性的新品种和新材料。本发明为提高植物对真菌病害的抗性提供了一种新的方法，利用基因工程技术培育抗性植物品种和材料具有明显的优势和不可取代的重要性；它不仅可以为大规模生产农作物、药材、园艺植物等提供方便，大量减少化学农药的使用，还可以为农业生产节约成本、减小环境污染，因此本发明具有广阔的市场应用前景。