一种脱细胞基质凝胶海绵及其制备方法与流程

本发明属于组织工程，具体涉及一种脱细胞基质凝胶海绵及其制备方法。

背景技术：

1、医用敷料是指用以覆盖疮、伤口，控制伤口感染的包伤医用材料。传统敷料主要使用脱脂棉纱布、纱布条、棉球和棉垫等天然纤维性材料类敷料，可使创面干燥，具备物理隔离功能，但这类敷料存在与渗出物结痂，造成创口粘连，换药时引发疼痛，以及细菌滋生、保湿和止血性能不佳等问题。相对传统敷料，现代生物敷料具有保湿、吸湿性好，能有效保留创面渗液的同时不保留积液，创面组织处粘连程度轻，不易与创面渗液粘连成痂，减轻换药时的痛苦；抗菌、抑菌性能较好，预防创面感染等优点。

2、在种类繁多的现代生物敷料中，海绵敷料因其三维网络结构，能为细胞迁移、增殖提供支架，促使毛细血管生成，加速肉芽组织生长的优势，在伤口敷料应用中显示出极大的吸引力。目前，市面上最常见的海绵敷料是从动物结缔组织中（如牛跟腱、牛肌腱等）提取出的胶原蛋白制成的海绵，由于其多孔的结构形态，可有效诱导修复细胞在敷料中的浸润和增值，加速肉芽组织生长，为组织的生长提供丰富的营养物质。尽管动物源性胶原蛋白产品有诸多优势，但其提取方法复杂，过程繁多，另外从动物组织中提取出的胶原蛋白虽说不一定会产生异体排斥反应，但仍存在一定的免疫原性风险，且在运输、保存、行业标准等方面均存在一定限制性。

3、胶原蛋白除了可以从结缔组织提取外，还可以将动物组织器官的细胞外基质(ecm)进行脱细胞处理获得，即去除细胞而保留其生物活性成分（例如碱性成纤维细胞生长因子（bfgf）、转化生长因子-β1（tgf-β1）、血管内皮生长因子（vegf））。大大降低甚至消除了动物源组织的免疫原性。目前脱细胞ecm的来源广泛，可从人体、猪、牛或羊的皮肤、心脏瓣膜、胎盘羊膜、小肠粘膜、膀胱基底膜、韧带、血管、神经、软骨、食道和气管等器官获得。与传统从动物组织中提取出的胶原蛋白相比，细胞外基质中的胶原蛋白更加复杂，不仅胶原的序列更全，而且保留了完整的胶原三螺旋的结构，相对于单一或简单提取出的胶原蛋白，抗原性更低、生物相容性更好、修复效果更佳。利用脱细胞基质制备生物敷料海绵的三维结构与体内细胞生长的天然环境更加接近，不仅能起到支撑细胞的作用，为后续的组织修复再生提供良好的生物力学支持。还富含多种生长因子，为后续的原位诱导提供足够的物理、化学、生物信号。

4、尽管如此，由脱细胞基质制备的海绵仍然存在与传统胶原蛋白海绵相似的缺点，即支架孔径分布难以控制和机械性能不足，尤其是脱细胞基质经过粉碎、消化、凝胶、冷冻干燥等处理后，入水极易溶散，这也限制了其在相关领域的应用。为了解决上述问题，一般通过引入化学交联反应获得机械性能良好的脱细胞基质凝胶海绵。尽管引入交联剂能改善海绵机械性能不足的问题，但现有的化学交联剂大部分都是以溶液的形式进行反应，海绵冷冻干燥后需反复清洗以除去残留的交联剂，多次的洗涤将导致脱细胞基质凝胶海绵内部的孔隙塌陷、孔径减小，在后续细胞生长的过程中无法满足生长增殖条件，影响修复效果。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种脱细胞基质凝胶海绵及其制备方法。

2、为达此目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种脱细胞基质凝胶海绵的制备方法，所述脱细胞基质凝胶海绵的制备方法包括以下步骤：

4、（1）脱细胞基质被蛋白酶溶液消化获得预备液；调节预备液的ph值，将预备液与缓冲液混合得脱细胞基质凝胶液；

5、（2）脱细胞基质凝胶液进行冷冻干燥获得疏松多孔的脱细胞基质凝胶冻干物；

6、（3）脱细胞基质凝胶冻干物进行气态交联，干燥得所述脱细胞基质凝胶海绵。

7、本发明通过引入气态交联剂的方式对海绵进行交联，这种交联方式无需使用溶剂洗脱，很好地避免了传统交联方式中还需采用二次冷冻干燥去除液体溶剂的过程，既提高了海绵的机械性能，又避免了因多次冷冻干燥引起孔径减小的问题。

8、优选地，所述脱细胞基质的原料选自皮肤组织、心脏瓣膜、胎盘羊膜、小肠粘膜、膀胱基底膜、韧带、血管、神经、软骨、食道或气管中的任意一种。

9、优选地，所述蛋白酶为胃蛋白酶。

10、优选地，所述脱细胞基质被蛋白酶溶液消化时的ph值为1~3，例如1.1、1.3、1.45、2、2.3、2.5、2.7、3等。

11、优选地，步骤（1）所述消化的时间为24~48h；例如24h、26h、28h、30h、35h、37h、40h、43h、45h、48h等；上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

12、优选地，步骤（1）所述预备液的ph值调节至6~8，例如6、6.3、6.5、6.8、7、7.2、7.4、7.8、8等，上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

13、优选地，步骤（1）所述消化的温度为20~28℃，例如20℃、22℃、24℃、26℃、28℃等，上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

14、优选地，步骤（1）所述缓冲液与预备液的体积比为1:(1~11)，例如1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11等，上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

15、优选地，步骤（2）所述冷冻干燥包括以下步骤：

16、（s1）将脱细胞基质凝胶液置于容器内，静置凝固得脱细胞基质凝胶；

17、（s2）按预设的脱细胞基质凝胶预冻程序对脱细胞基质凝胶进行预冻；

18、（s3）按预设的脱细胞基质凝胶升华干燥程序对步骤（s2）中预冻处理过的脱细胞基质凝胶进行升华干燥；

19、（s4）按预设的脱细胞基质凝胶解析干燥程序对步骤（s3）中升华干燥处理过的脱细胞基质凝胶进行解析干燥，得到疏松多孔的脱细胞基质凝胶冻干物。

20、优选地，所述容器内脱细胞基质凝胶溶液的填料高度为0.4~1.5cm；例如0.4cm、0.5cm、0.6cm、0.8cm、0.9cm、1cm、1.1cm、1.2cm、1.3cm、1.4cm、1.5cm等，上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

21、优选地，步骤（s1）所述脱细胞基质凝胶液的浓度为10~20mg/ml；例如10mg/ml、12mg/ml、14mg/ml、15mg/ml、17mg/ml、18mg/ml、20mg/ml等，上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

22、优选地，所述静置凝固的时间为0.5~1.5h；例如0.5h、0.6h、0.8h、1h、1.2h、1.3h、1.4h、1.5h等，上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

23、优选地，所述静置凝固的温度为30-40℃，例如30℃、32℃、34℃、36℃、37℃、38℃、40℃等，上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

24、优选地，步骤（s2）所述预冻程序包括以下步骤：

25、（t1）依次将温度调节至≤-30℃（例如-60℃、-55℃、-50℃、-45℃、-40℃、-35℃、-30℃等，优选为-45℃~-30℃），过渡时间为≥0.2h（例如0.2h、0.3h、0.4h、0.5h、0.8h、1h、1.2h、1.5h、1.8h、2h等，优选为0.2~0.5h），恒温≥1h（例如1h、1.2h、1.5h、1.8h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h等，优选为1~2h）；

26、（t2）升温，再将此温度升温至此范围：下限温度高于前一段温度至少7℃（例如7℃、7.5℃、8℃、8.5℃、9℃、9.5℃、10℃等），上限温度≤-20℃，过渡0.2-0.5h（例如0.2h、0.3h、0.4h、0.5h等），恒温1-2h（例如1h、1.2h、1.5h、1.8h、2h等）；

27、（t3）降温，最后将温度再次降温至≤-30℃（例如-60℃、-55℃、-50℃、-45℃、-40℃、-35℃、-30℃等，优选为-45℃~-30℃），过渡时间≥0.2h（例如0.2h、0.3h、0.4h、0.5h、0.8h、1h、1.2h、1.5h、1.8h、2h等，优选为0.2~0.5h），恒温时间≥1h（例如1h、1.2h、1.5h、1.8h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h等，优选为1~2h）。

28、本发明采用上述特定工艺参数的预冻工艺，并在此范围内通过对预冻参数进行调整，可以有效改善海绵的孔径大小，从而改善海绵的吸液能力和保水能力。

29、步骤（s3）所述升华干燥程序在真空度不大于30pa的条件下进行，优选为10~30pa，例如可以是10pa、12pa、15pa、18pa、20pa、22pa、25pa、28pa、30pa等，上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

30、优选地，步骤（s3）所述升华干燥程序包括以下步骤：

31、（r1）将温度调节至-30~-25℃（例如-30℃、-29℃、-28℃、-27℃、-26℃、-25℃等），过渡时间为0.1~0.2h（例如0.1h、0.11h、0.12h、0.15h、0.18h、0.2h等），恒温8~16h（例如8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h等）；

32、（r2）升温至-25~-15℃（例如-25℃、-22℃、-20℃、-18℃、-17℃、-15℃等），升温时间为0.1~0.2h（例如0.1h、0.12h、0.15h、0.18h、0.2h等），恒温8~16h（例如8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h等）。

33、本发明采用上述特定工艺参数的升华干燥工艺，可以去除工艺体系中的自由水，并可以有效防止产品内部温度超过材料的塌陷温度，进而可以有效避免海绵在冻干过程中发生塌陷，从而改善海绵的机械性能。

34、优选地，步骤（s4）所述解析干燥程序包括：将温度调节至10~20℃（例如10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、16℃、18℃、20℃等），过渡时间为0.5~1h（例如0.5h、0.6h、0.7h、0.8h、0.9h、1h等），恒温8~10h（例如8h、8.5h、9h、9.5h、10h等）。

35、优选地，所述解析干燥程序在真空度不大于30pa的条件下进行，优选为10~30pa，例如可以是10pa、12pa、15pa、18pa、20pa、22pa、25pa、28pa、30pa等，上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

36、优选地，步骤（3）所述的气态交联包括以下步骤：

37、（p1）用交联剂对脱细胞基质凝胶冻干物进行蒸汽气态交联；

38、（p2）真空干燥去除气态交联残留的交联剂。

39、本发明通过气态交联的方式制备脱细胞基质凝胶海绵，可以有效避免液态交联剂使用后需用溶液洗脱的缺陷，避免了重复多次的冻干处理所引起的海绵塌陷，机械性能下降的风险。

40、优选地，所述交联剂选自戊二醛、多聚磷酸钠、海藻酸二醛溶液或其他蒸发温度在30-37℃的交联剂中的任意一种；

41、优选地，所述交联剂溶液的浓度为0.1%~0.5%，例如0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%等。

42、本发明采用上述特定浓度范围的交联剂，可以进一步提升交联效果。

43、优选地，所述气态交联的时间为18~72h；例如18h、20h、30h、36h、48h、56h、60h、72h等。

44、本发明通过控制气态交联的时间在上述特定范围中，可以进一步优化交联效果。

45、优选地，所述气态交联的温度为30~37℃，例如30℃、32℃、34℃、36℃、37℃等。

46、优选地，所述真空干燥的温度为30~37℃，例如30℃、32℃、34℃、36℃、37℃等。

47、优选地，所述真空干燥的时间为8~16h，例如8h、9h、10h、12h、13h、14h、16h等，上述数值范围内具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

48、第二方面，本发明提供一种根据第一方面所述脱细胞基质凝胶海绵的制备方法制备的脱细胞基质凝胶海绵。

49、优选地，所述脱细胞基质凝胶海绵的孔隙率为60%~90%，孔径为100~200μm，断裂伸长率为15~30%。

50、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

51、本发明优先优化脱细胞基质凝胶海绵的冷冻干燥参数以获得孔径符合细胞生长要求且均匀的脱细胞基质凝胶海绵支架，再通过引入气态交联剂的方式对海绵进行交联，这种交联方式无需使用溶剂洗脱，既提高了海绵的机械性能，又避免了因多次冷冻干燥引起孔径减小的问题。

52、另外，现有技术通常是通过添加外来物质使得孔径分布均匀，而本发明无需添加外来物质，仅依靠调节冷冻干燥即可

53、而且，现有交联技术通常是将交联剂加入原材料中混合均匀后，冻干。这往往导致交联剂难以洗脱，而本发明是先制成海绵，再去用交联剂蒸汽进行交联，较容易去除交联剂。