产γ-氨基丁酸的乳杆菌的高通量筛选方法与流程

本发明涉及一种产γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，gaba)的乳杆菌的高通量筛选方法，结合产气法和测定菌液ph值两种低成本且快速的方法，使产gaba乳杆菌的筛选更加准确高效。

背景技术：

1、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，gaba)是一种由谷氨酸脱羧酶(glutamatedecarboxylase，gad)催化l-谷氨酸脱羧产生的非蛋白质氨基酸，广泛存在于动植物和微生物中。gaba被认为是一种具备食用安全性且具有多种生理功能的生物活性成分。gaba作为一种主要的抑制性神经递质，在哺乳动物的中枢神经系统种传送化学信息，此外，gaba还具有改善睡眠、抗抑郁、降血压等多种生理功能。

2、目前，虽然多种食物中含有gaba，但其含量低，无法满足人类的需求。而乳杆菌作为gaba的重要来源，因其具有生长速度快、所需空间小、发酵易于控制等众多优点，逐渐走入人们的视线。并且，乳杆菌是国际公认的益生菌，其发酵产品的安全性已经过市场的考验。

3、随着对gaba的深入研究，gaba的检测从定性到定量都有了许多可行的方法，如纸层析法、薄层色谱法、分光光度计比色法和高效液相色谱法等；但这些传统方法中，纸层析法及薄层色谱法步骤较多、操作较复杂，高效液相色谱的成本较高等；分光光度计比色法无法去除培养液中游离铵的干扰，检测误差较大。这次方法皆存在成本较高或操作复杂难以实现高通量的问题。

4、因此，建立低成本且快速的筛选产gaba乳杆菌的方法具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的一个目的在于提供一种筛选产γ-氨基丁酸的乳杆菌的方法。

2、具体地，本发明提供了一种筛选产γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，gaba)的乳杆菌的方法，该方法包括：

3、将待选乳杆菌在筛选用培养基中进行培养；其中，所述筛选用培养基为含有谷氨酸和/谷氨酸钠的培养基；

4、根据培养过程中的产气情况和培养基ph值，评估待选乳杆菌产γ-氨基丁酸的能力。

5、本发明的筛选方法对于乳杆菌具有普适性，所述待选乳杆菌可以为短乳杆菌、植物乳杆菌或发酵乳杆菌等。

6、根据本发明的具体实施方案，本发明的筛选方法中，所述筛选用培养基为液体培养基。

7、根据本发明的具体实施方案，本发明的筛选方法中，所述筛选用培养基为含有msg的mrs液体培养基。更具体地，所述筛选用培养基为含0.3％-3％msg的mrs液体培养基。

8、根据本发明的具体实施方案，本发明的筛选方法中，所述筛选用培养基为经过除气的培养基，以避免培养基本身所含气体会对产气结果造成干扰。优选地，可采用超声对培养基进行除气。此外，接菌过程种吹吸尽量轻柔，排除培养基中气体干扰的同时，确保菌株接入不会产生气泡。

9、根据本发明的具体实施方案，本发明的筛选方法中，可采用震荡观察培养基菌液气泡以判断是否产气，或者采用扣盖型试管进行乳杆菌的培养通过观察培养过程中是否顶盖以判断是否产气。由于有些乳酸菌进行异型发酵，如短乳杆菌和发酵乳杆菌等，其发酵葡萄糖本身就会产生气体，如果仅是通过震荡观察菌液气泡等方法对菌株产气结果进行简单检测，则此类异型发酵的菌株会干扰产气结果，导致误判。因此，对于待选乳杆菌为异型发酵的菌株时，可采用扣盖型试管进行培养通过观察培养过程中是否顶盖以判断是否产气。

10、根据本发明的具体实施方案，本发明的筛选方法，采用以下方式评估待选乳杆菌产γ-氨基丁酸的能力：

11、待选乳杆菌在筛选用培养基中培养至稳定期时，产气且ph值较高的菌株，具备产γ-氨基丁酸的能力；和/或

12、待选乳杆菌在筛选用培养基中培养至稳定期时，产气且ph值升高的菌株，具备产γ-氨基丁酸的能力。

13、根据本发明的具体实施方案，待选乳杆菌在筛选用培养基中培养至稳定期的操作可以按照所属领域的常规操作进行。本发明中检测菌株顶盖及测定ph值的时间需要避免菌株生长特性的干扰，选择在菌株生长的稳定中后期进行测定。通常情况下，植物乳杆菌通常会比短乳杆菌更早进入稳定期，其菌液ph会早于短乳杆菌下降并趋于稳定。

14、根据本发明的具体实施方案，本发明的筛选方法包括：

15、待选乳杆菌菌种进行活化传代制成种子培养菌液，接种到筛选用培养基中进行培养；优选地，种子培养菌液的接种量为0.5％-3％；优选地，活化传代、制备种子培养菌液采用的培养基各自独立地为mrs液体培养基；

16、待选乳杆菌在筛选用培养基中培养至24h-72h优选36h-48h时，观察培养过程中的产气情况，并测定培养液ph值，评估待选乳杆菌产γ-氨基丁酸的能力。

17、根据本发明的具体实施方案，本发明的筛选方法中，待选乳杆菌为短乳杆菌，其在培养至24h-72h优选36h-48h时产气，并且培养过程中ph值先降低再升高，评估其具备产γ-氨基丁酸的能力。在本发明的一些优选实施方案中，待选乳杆菌在培养至48h时ph值升高至5.0以上优选5.3以上，评估其具备产γ-氨基丁酸的能力。

18、根据本发明的具体实施方案，本发明的筛选方法中，待选乳杆菌为植物乳杆菌，其在培养至24h-72h优选36h-48h时产气且具有较高ph值，评估其具备产γ-氨基丁酸的能力。在本发明的一些优选实施方案中，待选乳杆菌在培养至48h时ph值在4.2以上优选4.3以上更优选4.4以上，评估其具备产γ-氨基丁酸的能力。

19、本发明的筛选方法，主要是根据gaba的生物合成原理，围绕其合成底物和产物的特性，运用产气法和菌液ph值法，分别对其反应产物和底物进行鉴定，再将两种方法的结果相结合，即是否同时具有产气现象和高ph值现象，共同判断一株乳杆菌的产gaba能力。在本发明的一些具体实施方案中，经过薄层色谱法和高效液相色谱法的验证，本发明的筛选方法的准确性得以验证，准确率可达100％。并且，本发明的筛选方法与传统筛选该方法相比，还具有简单易操作、成本低且高通量的优点。

技术特征：

1.一种筛选产γ-氨基丁酸的乳杆菌的方法，该方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述筛选用培养基为液体培养基；

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述筛选用培养基为含0.3％-3％msg的mrs液体培养基。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中，所述筛选用培养基为经过除气的培养基；

5.根据权利要求2-4任一项所述的方法，其中，采用震荡观察培养基菌液气泡以判断是否产气，或者采用扣盖型试管进行乳杆菌的培养通过观察培养过程中是否顶盖以判断是否产气。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，采用以下方式评估待选乳杆菌产γ-氨基丁酸的能力：

7.根据权利要求1所述的方法，其包括：

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中，所述待选乳杆菌为短乳杆菌、植物乳杆菌或发酵乳杆菌。

9.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中，待选乳杆菌为短乳杆菌，其在培养至24h-72h优选36h-48h时产气，并且培养过程中ph值先降低再升高，评估其具备产γ-氨基丁酸的能力；

10.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中，待选乳杆菌为植物乳杆菌，其在培养至24h-72h优选36h-48h时产气且具有较高ph值，评估其具备产γ-氨基丁酸的能力；

技术总结本发明提供了一种产γ‑氨基丁酸的乳杆菌的高通量筛选方法。具体地，本发明提供了一种筛选产γ‑氨基丁酸的乳杆菌的方法，该方法包括：将待选乳杆菌在筛选用培养基中进行培养；其中，所述筛选用培养基为含有谷氨酸和/谷氨酸钠的培养基；根据培养过程中的产气情况和培养基pH值，评估待选乳杆菌产γ‑氨基丁酸的能力。本发明的方法具有简单快速、低成本高通量的特点，能够快速从大量乳杆菌中筛选出产GABA的菌株。技术研发人员：孙婷,马霞,洪维鍊,刘福东,赵雯,刘伟贤受保护的技术使用者：内蒙古伊利实业集团股份有限公司技术研发日：技术公布日：2024/9/29