不育剂组合物、试剂盒及其使用方法与流程

本公开总体上涉及基于雷公藤甲素(雷公藤内酯，triptolide)、棉酚(gossypol)及其可接受的盐的组合物或试剂盒。当前的组合物或试剂盒可用于限制或抑制出生率，包括诱导不育(infertility)——通过组合抑制线粒体乳酸脱氢酶(ldh)-c4和核因子κb(nf-κb)活性。

背景技术：

1、对动物的群体控制是世界范围内的重要问题，而生育力调节对于保护生命支持资源和动物福利是必要的。

2、家畜绝育已经应用了几个世纪，为的是控制动物的数量、遗传选择、攻击性动物的安宁，并确保生产满足人类需求的高质量肉类。主要的阉割方法有手术阉割、激素抑制和化学阉割。

3、理想的阉割应该是这样的：它将提供永久或连续的低成本治疗，阻止精子发生和产雄(androgenetic)，并且不影响动物福利水平[hassan,a.,fromsa,a.(2017).review onchemical sterilization of male dogs.international journal of advancedresearch,5(11),758-770]。

4、性腺切除手术避孕——手术去除雄性的睾丸或雌性的卵巢，导致性腺丧失产生性类固醇——常在动物中实施并产生永久和不可逆的效果。该程序存在数个可能的副作用，如生殖器官发育不全、肌肉骨骼系统紊乱、激素功能障碍、尿失禁、肿瘤风险、肥胖、换毛(coat changes)等。[root kustritz m.v.,2012.effects of surgical sterilizationon canine and feline health and on society.reprod.domest.anim.47,214–222]。然而，开放手术阉割需要术后护理才能使出血和感染风险最低。此外，这种方法也有一些缺点：成本不低且耗时长，同时有严重术后并发症风险。与其它方法相比，非手术化学绝育存在更好的优势，其中包括减少疼痛和压力，消除出血、疝、感染、蝇蛆病和其它手术后遗症。

5、与手术方法相比，不同的生殖生物学家接受了开发化学绝育方法的挑战，这种方法可能是手术阉割更好的替代方法，以及适于雄性家畜大规模绝育而无术后危险。使用无机化学品、免疫避孕药和包括雄激素、孕激素、雄激素加孕激素以及促性腺激素释放激素(gnrh)激动剂在内的激素，尝试了不同的化学剂来实现阉割。不同研究人员评估了在多个种属的雄性动物中注射各种激素的非手术绝育，但这些治疗未能诱导永久不孕(sterility)。免疫技术也被用于诱导抗促性腺激素和gnrh的抗体，并且表明了这种免疫技术在无精子症的有效性和持续时间方面各不相同。疫苗接种不良反应也被认为是另一个缺点。化学绝育已应用于一些雄性动物种属，如猴、山羊、公牛、仓鼠、兔和狗。

6、因此，研究人员在过去几年中也尝试了各种化学剂，如达那唑(danazol)、甘油、乳酸、氯化铁和硫酸亚铁、氯化钙(cacl2)、卡介苗(bcg)、葡萄糖酸锌(neutersol)和20％高渗盐溶液，用于诱导化学绝育。然而，所有这些化学剂经睾丸内注射后都表现出疼痛、发热，甚至严重的睾丸炎症(睾丸炎)。一些剂如氯化镉、甘油、乳酸引起了睾丸组织的选择性破坏，并伴有可逆的睾丸组织损伤。虽然所使用的化学品对睾丸组织的破坏有影响，但它还有并发症和一些缺点。例如，在某些情况下，生精小管的间质部分在睾丸萎缩的初期后再生，而这导致了继发的雄性行为，引起动物的管理问题。由于使用上述化学品所引起的这类并发症，有效的化学绝育剂尚未确立。

7、已经报道了几种推定的雷公藤甲素靶蛋白，包括多囊蛋白-2、adam10、dctpp1、tab1和xpb。xpb(ercc3)及其伴侣蛋白gtf2h4存在多重雷公藤甲素耐药突变。然而，在多囊蛋白-2、adam10、dctpp1和tab1中没有发现雷公藤甲素耐药突变。xpb的cys342被鉴定为通过雷公藤甲素的12,13-环氧基团进行共价修饰的残基，并且xpb-c342t突变体使得t7115细胞系几乎完全对雷公藤甲素耐药。c342t突变赋予的耐药水平是先前鉴定的大多数雷公藤甲素耐药突变体的约100倍之高。总之，这些结果证实了xpb是负责雷公藤甲素抗增殖活性的靶点。

8、明尼甲素(minnelide)是雷公藤甲素的一种水溶性更高的合成类似物，其在体内转化为雷公藤甲素。在胰腺癌的临床前小鼠模型中，它“甚至比吉西他滨更有效”。

9、糖化雷公藤甲素(glutriptolide)是雷公藤甲素的葡萄糖缀合物，具有更好的溶解性和更低的毒性，在体外不抑制xpb活性，但在体内表现出肿瘤控制，这可能是由于活性雷公藤甲素在癌细胞内持续逐步释放。

10、来自雷公藤(tripterygium wilfordii)的二萜雷公藤甲素在体外抑制一系列细胞因子和趋化因子的产生和基因表达，包括il-1β、il-6、tnf-α和ifn-γ，同时它还通过抑制cox-2基因减少pge2产生。雷公藤甲素的其它机制效应包括通过抑制iκbα磷酸化来抑制nf-κb信号传导，并且它可调节t细胞反应，因为它也可抑制体外il产生。此外，雷公藤甲素还抑制il-1α诱导的人滑膜成纤维细胞前基质金属蛋白酶(mmp)-1和-3的产生以及mrna水平，以及软骨细胞和滑膜成纤维细胞中细胞因子诱导的mmp-3、mmp-13和可聚蛋白聚糖-1基因表达。

11、人乳酸脱氢酶(ldh)有五种同工酶。在厌氧葡萄糖条件下，丙酮酸在nadh的存在下被ldh还原成乳酸。大量报道表明，棉酚的抗生育特性具体与(-)-异构体相关。(-)-棉酚是nadh与ldh结合的非选择竞争性抑制剂。据认为，其抗生育作用是由于对线粒体ldh-c4(ldh-x)的抑制，而ldh-c4只存在于睾丸和精子中，并且是产生能量所必需的。然而，其作用方式复杂并且涉及许多必需酶系统的抑制，包括核糖核苷酸还原酶、苹果酸脱氢酶(mdh)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ga3pdh)和细胞质磷脂酶a2(cpla2)。后一种酶在精子成熟过程中的顶体反应中起重要作用。在啮齿类动物和细胞培养模型中对cpla2α表达的遗传操纵致使对该酶如何影响细胞稳态和疾病有了更好的理解。cpla2α在胚胎着床和生育中起到重要作用。cpla2α还与过敏性炎症、哮喘、肺癌转移、脊髓损伤、阿尔茨海默病和c型尼曼匹克胆固醇贮积障碍(niemann pick type c cholesterol storage disorder)的病理生理学有关。对最近发现的c1p转运蛋白的抑制，导致cpla2α活性和类花生酸产量增加。因此，c1p水平与cpla2α活性之间的相关性提供c1p/类花生酸轴导致上述疾病的证据。cpla2δ与银屑病有关，但其它cpla2同种型在疾病中的作用将需要更多的研究努力。

12、在cns中，spla2 mrna响应于促炎细胞因子tnf-α、il-1β和ifn-γ表达。在损伤部位，pla2产物(即花生四烯酸)被代谢成促炎代谢物如前列腺素e2(pge2)，它不仅促进巨噬细胞和小胶质细胞募集，而且增加局部血流并增强血管通透性和促炎细胞因子表达。

13、雷公藤甲素具有复杂的作用机制，涉及抑制转录因子核因子κb(nf-κb)活化、抑制前列腺素e2的产生和降低细胞因子水平。先前报道雷公藤甲素抑制转录因子nf-κb。然而，尚不清楚抑制nf-κb活化是否与雷公藤甲素抑制stat 3活化有关。nf-κb和stat 3被不同的细胞因子活化；例如，肿瘤坏死因子是nf-κb的主要活化因子，而il-6活化stat 3。然而，值得注意的是，据报道ja k活化同时调节stat 3和nf-κb活化(53)。因此，雷公藤甲素是一种靶向ja k调节的强力化疗剂，ja k调节nf-κb和stat 3活化。值得注意的是，雷公藤甲素抑制骨髓增殖性障碍细胞中的詹纳斯激酶(ja k)2途径，该疾病与mm类似(22)。

14、jak/stat蛋白的成员tyk 2、stat 1和stat 4存在于人类精子中且具有活性。stat1和stat 4蛋白在精子头部顶端区域的定位以及它们被ifn-a、ifn-g或il-12活化，表明精子stat蛋白在受精中的作用。我们假设精子来源的磷酸化stat 1和stat 4可能有助于精子-卵母细胞融合过程中转录因子的汇集(pool)，以及向卵母细胞核传递信号。因此，精子tyk 2和stat 1或stat 4介导的信号传导途径的缺陷可能与雄性因素不育有关。

15、棉酚是一种来自棉花植物(棉属)的天然酚。棉酚是一种渗透细胞并作为几种脱氢酶抑制剂的酚醛。它是一种黄色颜料。该结构表现出轴向手性，两种对映体具有不同的生物化学性质。在其它应用中，它已经在中国作为雄性口服避孕药进行了测试。除了其推定的避孕性质外，棉酚还一直已知具有抗疟疾性质。

16、在体外研究了醋酸棉酚——一种强力的雄性不育剂——对山羊肝脏ldh(ldh-a4)、心脏ldh(ldh-b4)和睾丸ldh(ldh-c4)的影响。当反应在丙酮酸-乳酸(正向)或乳酸-丙酮酸(反向)方向进行时，所有ldh制剂均被棉酚抑制。在25℃和ph 7.4下，在0.27mm丙酮酸和0.15mm nadh的存在下，棉酚通过ldh同工酶氧化丙酮酸的ic50在16与42之间变化，而对于乳酸氧化，在25℃和ph 9.0下，在含有3.3mm乳酸和1.8mm nad的系统中，ic50为125μm。lineweaver-burk的倒数图显示，这些同工酶关于丙酮酸和乳酸以非竞争性方式受到抑制，而当nad和nadh作为底物变化时，以竞争性方式受到抑制。在棉酚存在下，ldh-a4、-b4和-c4同工酶对丙酮酸的ki值分别为20、34和29μm；对nadh的ki值分别为33、43和45μm；对乳酸的ki值分别为85、85和125，以及对nad的ki值分别为94、108和83μm。

17、然而，传统的化学绝育需要捕获动物并由兽医或专业人员提供治疗，然后释放动物。此外，在某些情况下，需要不止一种治疗。整个程序既费时又昂贵，而且需要个体治疗和护理。

技术实现思路

1、以下描述是实施本发明示例性实施方式的最佳当前预期模式。由于本发明的范围由所附权利要求最佳限定，因此以下描述不应被理解为限制性的，而仅仅是为了说明本发明的一般原理。

2、在一个实施方式中，本文提供组合物，其包括：(a)雷公藤甲素、雷公藤甲素前药、雷公藤甲素的药学上可接受的盐、雷公藤甲素前药的药学上可接受的盐或其任意组合；和(b)棉酚、棉酚的药学上可接受的盐或其组合。

3、在进一步的实施方式中，雷公藤甲素、雷公藤甲素前药、雷公藤甲素的药学上可接受的盐、雷公藤甲素前药的药学上可接受的盐、棉酚、棉酚的药学上可接受的盐或其任意组合：是提取自植物的、是合成的或是半合成的。

4、在进一步的实施方式中，本文所述的组合物还包括至少一种另外的活性成分。在一个实施方式中，所述另外的活性成分包括抗细菌剂或抗病毒剂。

5、在进一步的实施方式中，本文所述的组合物是口服剂型或可注射剂型。

6、在一个实施方式中，本文提供试剂盒，其包括：第一组合物，所述第一组合物包括：雷公藤甲素、雷公藤甲素前药、雷公藤甲素的药学上可接受的盐、雷公藤甲素前药的药学上可接受的盐或其任意组合；和第二组合物，所述第二组合物包括：棉酚、棉酚的药学上可接受的盐或其组合。

7、在一个实施方式中，本文提供用于在对象中限制生育、诱导避孕、诱导流产、诱导性不孕、不育、抑制的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的如本文所述的组合物或如本文所述的试剂盒，从而限制生育、诱导避孕、诱导流产、诱导性不孕或不育。

8、在进一步的实施方式中，所述对象是哺乳动物、爬行动物或鸟类。

9、在进一步的实施方式中，施用包括使生殖器官与所述组合物接触。

10、在进一步的实施方式中，所述第一组合物和所述第二组合物分别或依次施用。

11、在进一步的实施方式中，所述第一组合物和所述第二组合物同时施用。

12、在进一步的实施方式中，施用包括口服施用。

13、在进一步的实施方式中，施用包括向生殖器官施用。

14、在进一步的实施方式中，所述对象是雄性。在进一步的实施方式中，所述对象是雌性。在进一步的实施方式中，所述对象是哺乳动物或鸟类。