一种水稻雄性半不育突变体

本发明涉及基因工程，尤其涉及一种水稻雄性半不育突变体。

背景技术：

1、水稻是我国的主要经济粮食作物，世界三分之一的人口以大米为食，水稻产量的提高事关世界粮食安全。而雄性不育突变体主要应用于杂交育种，因此研究和了解水稻雄性生殖器官花药的发育机制，对通过遗传改良提高水稻的产量具有重要意义。目前杂交水稻的发展已有传统的三系法以及两系法以及普通核不育系。普通细胞核雄性不育(sgms)是指受隐性核基因控制且不被外界环境影响的雄性不育。水稻雄性育性研究对于水稻杂交优势利用具有重要的价值。水稻雄性器官的生长发育是一个连续且复杂的生理活动过程。生殖发育是植物发育中很重要的过程，涉及到花粉减数分裂、绒毡层降解、花粉壁形成、花药开裂、花粉管伸长、双受精等一系列的生物学过程，研究表明造成雄性不育的核基因众多。

2、关于调控水稻雄性育性的基因不断被研究人员发现并报导。目前发现tdr、udt1、eat1、ptc1等基因通过影响水稻花药绒毡层的发育来调控水稻雄性育性，这些基因发生突变体，会导致绒毡层出现不同层度的延迟降解，进而导致水稻植株雄性不育；例如tdr主要在花药绒毡层表达，尤其在小孢子阶段表达最强烈，tdr通过调节osadf表达，调控水稻花药发育。水稻花药必及花粉粒壁的的结构及发育也是影响雄性育性的重要因素。

3、cyp704b2调控水稻花药壁和花粉壁的生长发育；dpw3基因编码一个脂类转运蛋白，该基因影响花粉外壁孢粉素的沉积，花粉粒中淀粉的积累，进而影响花粉的育性。dpw编码的脂酰基载体蛋白还原酶参与花药中的角质单体、角质层蜡质等物质的合成，dpw参与了花药及花粉外壁的合成。wda1、cyp703a3和osltrg47等基因也调控孢粉素和花粉壁的形成；调控水稻雄性器官生长发育的基因越来越多的报导出来。突变体osnp2是新的水稻雄性不育基因的dpw等位突变体，据相关研究两者都可作为第三代智能不育性的试验材料。

4、2010年邓兴旺等通过构建三元连锁表达载体，第一次成功批量繁殖普通核不育系；该载体主要利用了隐性核不育突变体ms26/ms26(武运粳7号)，通过遗传转化野生型雄性可育基因ms26、花粉失活基因zm-aa1和筛选标记基因dsred2构成。目前水稻杂交优势的利用，水稻雄性育性也是关键部分。水稻雄性器官生长发育涉及众多基因的精密调控及相互作用，因此调控水稻雄性育性的相关基因仍需要不断挖掘，由此才可进一步探明水稻雄性育性的调控机理。

技术实现思路

1、针对以上不足，本发明提供一种水稻雄性半不育突变体，具体技术方案如下：

2、通过对水稻及拟南芥的蜡质脂质合成代谢的相关基因进行敲除，筛选育性降低表型的突变体，获得一个育性降低表型的突变体，该突变体是对水稻osfatb基因进行基因编辑(osfatb基因编码一个脂肪酰基硫酯酶，可以水解酰基acp化合物，形成游离的脂肪酸)，由此命名为osfatb突变体，该突变体osfatb的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述基因编辑通过crispr/cas9系统进行，所述水稻osfatb基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述基因编辑采用的靶点序列的核苷酸序列如seq id no.3和seq id no.4所示。

3、本发明还提供了一种用于敲除osfatb基因的敲除载体，所述敲除载体osu6a和osu6b启动子的核苷酸序列分别如seq id no.9、seq id no.10和seq id no.11、seq idno.12所示。将该敲除表达载体进行基因敲除获得敲除osfatb基因缺失纯合突变体。

4、本发明还提供了一种含所述靶点序列的crispr/cas9-sgrna表达质粒。

5、本发明还提供了一种含所述靶点序列的敲除表达载体的大肠杆菌dh5α和农杆菌eha105。

6、本发明还提供了一种雄性半不育水稻突变体的制备方法，包括以下步骤：

7、(1)构建含有如权利要求3中所述靶标序列的crispr/cas9系统敲除表达载体；

8、(2)将所述敲除表达载体转化到农杆菌eha105中；

9、(3)用所述农杆菌eha105侵染水稻愈伤组织，对所述水稻愈伤组织进行诱导获得再生苗；

10、(4)筛选并鉴定出转基因纯合株系，即得所述雄性半不育水稻水稻突变体。

11、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

12、本发明通过crispr/cas9系统编辑osfatb基因，通过遗传转化野生型中花11水稻品种，得到阳性突变体单株，测序法分析鉴定突变单株。通过该方法获得了一种具有重要价值的水稻雄性半不育osfatb突变体，与野生型日本晴相比，获得的osfatb突变体的性状表现为营养期生长同野生型一样，成熟期雌蕊发育正常，花粉粒半败育，部分结实，本发明对研究水稻雄性育性的调控机理有重要价值。

技术特征：

1.一种水稻雄性半不育突变体，其特征在于，所述突变体的核苷酸序列如seq id no.1所示。

2.一种水稻osfatb基因，其特征在于，所述水稻osfatb基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。

3.根据权利要求1所述的一种水稻雄性半不育突变体，其特征在于，所述突变体是通过crispr/cas9系统对权利要求2所述的水稻osfatb基因进行基因编辑获得，所述基因编辑采用靶点序列如seq id no.3和seq id no.4所示。

4.一种用于敲除如权利要求2所述的osfatb基因的敲除表达载体，其特征在于，所述敲除表达载体包含osu6a启动子和osu6b启动子，所述osu6a启动子序列如seq id no.9和seqid no.10所述，所述osu6b启动子序列如seq id no.11和seq id no.12。

5.一种含权利要求3所述的靶点序列的crispr/cas9-sgrna表达质粒。

6.一种含权利要求3所述靶点序列的敲除表达载体的大肠杆菌dh5α和农杆菌eha105。

7.一种如权利要求1所述的雄性半不育水稻突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

技术总结本发明公开了一种水稻雄性半不育突变体，涉及基因工程技术领域。本发明突变体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所涉及的基因命名为OsFATB，OsFATB的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，通过基因编辑敲除OsFATB基因获得水稻雄性半不育osfatb突变体。本发明获得了一种水稻雄性半不育osfatb突变体，所述的osfatb突变体出现花粉粒半败育，结实率下降现象，对完善水稻雄性育性的调控机理有重要作用。技术研发人员：覃宝祥,谭文叶,何娟,周师旭,徐一博,罗继景,刘芳,李容柏受保护的技术使用者：广西大学技术研发日：技术公布日：2024/9/29