重组人源II型胶原蛋白片段及基因、载体、菌和应用的制作方法

本发明涉及生物工程，尤其涉及一种重组人源ii型胶原蛋白片段及基因、表达载体、菌和应用。

背景技术：

1、胶原蛋白是人体中极其重要的结构蛋白，具有特殊的生物学功能，含量丰富，种类繁多，旨在支持器官和保护组织。人源的胶原蛋白抗原性弱，具有诱导细胞增殖、分化和促进细胞黏附的功能，可以维持细胞结构、提供血管支架等，其降解产物胶原水解物具备良好的抗氧化功能，因此成为创面辅料、化妆品、组织工程、医疗器械领域的重要材料。

2、胶原蛋白种类多达29种，研究最广泛的为i、ii和iii型胶原蛋白。其中，ii型胶原蛋白广泛分布在软骨、玻璃体和皮肤等结缔组织中，具有强拉伸性和抗压性，已作为一种生物材料在组织工程和再生医学等领域应用广泛。该类胶原蛋白全长1014个氨基酸，理论分子量为91.4kda，由3条α1链组成，每条α1链都形成一个右手螺旋结构，3条α1链进一步缠绕形成左手螺旋。在关节软骨中，ii型胶原蛋白可以维持关节软骨的弹性和韧性；在眼球中，ii型胶原蛋白可以维持眼球结构和玻璃体透明度。

3、目前，ii型胶原蛋白的生产主要通过动物组织提取法获得，例如从猪、牛、羊等动物的软骨中提取ii型胶原蛋白，但动物来源的胶原蛋白具有强抗原性，机体排异反应严重，存在病毒、传染病等安全隐患。

4、随着基因工程技术的不断进步，生产重组人源化胶原蛋白的技术逐渐成熟，包括以动物、昆虫细胞、大肠杆菌和毕赤酵母为宿主的表达系统。例如，孙京臣等构建了含重组质粒的杆状病毒多基因表达系统，使用大肠杆菌感染昆虫细胞后产生病毒液，将病毒液转染进昆虫细胞或直接注射入家蚕幼虫体内生产重组人ii型胶原蛋白。nokelainen m等将昆虫细胞与两种杆状病毒共感染，产生具有稳定三螺旋的软骨特异性ii型胶原。但动物和昆虫细胞表达体系生产成本高、周期长、产量低，仅局限于实验室水平，无法大规模生产。同时，一些研究人员使用大肠杆菌作为表达宿主重组表达类人ii型胶原蛋白肽，以及使用大肠杆菌表达人ii型胶原蛋白功能性多肽。然而，大肠杆菌表达系统蛋白表达量受限制，缺乏翻译后修饰，具有内毒素，且纯化步骤繁琐，增加生产成本。

5、以毕赤酵母为宿主表达重组人源化胶原蛋白，具有产量高、无内毒素、生产周期短、可高密度发酵、成本低等优点。钱松等成功利用毕赤酵母分泌表达人ii型胶原蛋白全长肽链，并在n端和c端分别添加特异性亲和纯化标签，发酵上清经镍柱纯化后得到具有生物活性的ii型胶原全长α1链。然而，全长胶原蛋白分子量过大，透皮效果差，起效时间和起效浓度受实际应用的限制。相比而言，胶原蛋白片段能够更有效地渗入角质层、真皮层，具有强自由基清除活性、脂质过氧化抑制能力、氧化和氧化损伤dna保护活性，可下调细胞内ros积累，起到延长皮肤细胞寿命、抑制过氧化、抑制酪氨酸的活性、提高皮肤免疫能力、提高皮肤持水保水能力、促进胶原的合成和真皮细胞透明质酸的合成等多种功效。但目前，对于人源ii型胶原蛋白的高活性胶原蛋白片段研究较少。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于提供一种重组人源ii型胶原蛋白片段及基因、表达载体、菌和应用。

2、本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：

3、一种重组人源ii型胶原蛋白片段，其氨基酸序列如seq id no.2所示。

4、作为本发明的优选方式之一，所述重组人源ii型胶原蛋白片段含一处“三肽信号识别位点rgd”、两处“ger”以及三处“gek整合素识别位点”。

5、一种重组人源ii型胶原蛋白片段的编码基因，所述基因的核苷酸序列如seq idno.1所示，用于编码权利要求1或2所述的重组人源ii型胶原蛋白片段。

6、作为本发明的优选方式之一，所述seq id no.1所示核苷酸序列为经密码子优化，适应毕赤酵母表达系统的序列。

7、一种表达载体，包括上述重组人源ii型胶原蛋白片段的编码基因。

8、作为本发明的优选方式之一，所述表达载体的构建方法为：在编码基因序列的5’端添加ecori酶切位点序列，3’端添加终止密码子和noti酶切位点序列；随后，将序列片段通过ecori和noti酶切位点插入到ppic9k表达载体，得相应重组表达载体。

9、一种重组毕赤酵母工程菌，包括上述重组人源ii型胶原蛋白片段的编码基因。

10、作为本发明的优选方式之一，所述重组毕赤酵母工程菌的构建方法如下：将通过所述重组人源ii型胶原蛋白片段的编码基因构建的表达载体线性化后，转入毕赤酵母gs115。

11、一种上述重组人源ii型胶原蛋白片段的制备方法，步骤如下：

12、(1)合成seq id no.1所示的编码重组人源ii型胶原蛋白单链的核苷酸序列；

13、(2)设计pcr引物，扩增获取编码重组人源ii型胶原蛋白单链的dna片段；

14、(3)构建包括所述编码重组人源ii型胶原蛋白单链的dna片段的重组表达载体，表达载体为ppic9k；

15、(4)将构建的表达载体线性化后，转入毕赤酵母gs115，获得重组毕赤酵母工程菌；

16、(5)培养上述重组毕赤酵母工程菌，表达重组人源ii型胶原蛋白片段；

17、(6)分离纯化步骤(5)中所表达的重组人源ii型胶原蛋白片段：使用透析、离子交换、二次透析进行重组ii型胶原蛋白片段的分离纯化。

18、一种上述重组人源ii型胶原蛋白片段在人工骨、人工软骨、人工眼角膜、玻璃体、创口修复材料、支撑型生物材料、医学美容整形、化妆品等领域的应用。

19、本发明相比现有技术的优点在于：

20、(1)本发明提供的重组人源ii型胶原蛋白片段，含一处“三肽信号识别位点rgd”、两处“ger”以及三处“gek整合素识别位点”(ger、gek位点可以被细胞膜上整合素识别位点识别，继而通过信号转导传递给细胞，促进细胞增殖与粘附；rgd位点可以被细胞膜上整合素识别位点识别，继而通过信号转导传递给细胞，促进细胞粘附，其还是胶原蛋白中一个三肽识别位点，有助于胶原蛋白形成三螺旋结构)，不仅具有显著的促进人软骨细胞增殖与迁移作用，在人永生化表皮细胞hacat、小鼠胚胎成纤维细胞nih/3t3中也分别表现出优异的促进细胞迁移、促进黏附的效果，且表现出良好的生物相容性和生物活性，不仅可应用于人工骨材料、角膜、玻璃体等ii型胶原常用领域，还可用于皮肤修复等领域；

21、(2)本发明根据毕赤酵母表达特点，对编码重组人源ii型胶原蛋白的核苷酸序列进行优化，使编码重组人源ii型胶原蛋白的核苷酸序列更适应毕赤酵母的表达系统，并通过小试表达快速筛选得到了一株重组ii型胶原蛋白高产菌种；

22、(3)本发明在纯化重组人源ii型胶原蛋白时，通过“透析与离子交换层析”结合进行纯化，获得高回收率、高纯度的重组人源ii型胶原蛋白；

23、(4)本发明使用毕赤酵母作为表达宿主来生产重组人源ii型胶原蛋白，具有无内毒素、可对胶原蛋白进行翻译后修饰以及可高密度发酵等优势，可充分支持以此胶原生产的胶原产品的生物学功能；

24、(5)本发明使用的表达载体ppic9k为分泌表达载体，可在工程菌自身生命活动中持续分泌表达胶原蛋白，发酵工艺简单，杂蛋白少，为发酵罐发酵生产提供了优势菌种。