一种提高金银花中绿原酸含量的重组基因及其应用

本发明涉生物医药领域，具体而言，涉及一种提高金银花中绿原酸含量的重组基因及其应用。

背景技术：

1、金银花是常用名贵中药，为忍冬科植物忍冬(lonicera japonica thunb.)的干燥花蕾及初开的花，其性甘寒、味甘气芳香，自古以来就被誉为清热解毒、疏风散热的良药；现代药理学研究表明其提取物具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、保肝、抗肿瘤等多种药理活性。金银花含有的绿原酸和木犀草苷是衡量金银花品质的指标性成分。

2、绿原酸具有广泛的生物活性，现代科学对绿原酸生物活性的研究已深入到食品、保健、医药和日用化工等多个领域。绿原酸是一种重要的生物活性物质，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基和兴奋中枢神经系统等作用。因此市面上绿原酸的需求量较大，价格也较昂贵。

3、提高金银花中的绿原酸的含量，能够在创造更多经济效益，提高药品质量、疗效和资源利用率。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种提高金银花中绿原酸含量的重组基因及其应用，解决背景提出所提出的至少一个技术问题。

2、第一方面，提供一种提高金银花中绿原酸含量的重组基因，所述重组基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

3、第二方面，提供一种上述提高金银花中绿原酸含量的重组基因编码的蛋白质。

4、第三方面，提供一种上述提高金银花中绿原酸含量的重组基因的植物表达载体。

5、第四方面，上述重组基因在提高金银花中绿原酸含量的应用。

6、第五方面，上述植物表达载体在提高金银花中绿原酸含量的应用。

7、第六方面，一种提高金银花中绿原酸含量的方法，所述方法包括：

8、构建重组质粒，所述重组质粒包含核苷酸序列如seq id no.1所示的重组基因；

9、采用农杆菌介导法将重组质粒转入到金银花叶片中，进行培养，获得目的植株。

10、优选的，所述构建重组质粒的步骤为：

11、提取金银花基因组dna，以所述金银花基因组dna为模板设计引物，在per-mir319基因的上下游均引入上游引入xbal酶切位点，下游引入xmal酶切位点，利用高保真酶从dna模板中扩增per-mir319基因序列，回收扩增出来的含有per-mir319基因的pcr产物；

12、使用xbal、xmal内切酶将pbi121酶切成线性化载体，用同源重组法将per-mir319基因与线性化pbi121载体连接，热激法将重组载体导入大肠杆菌dh5ɑ感受态，菌液pcr检测阳性菌落，提取阳性质粒，测序后获得含有目的基因的重组质粒。

13、优选的，将构建成功的重组质粒导入农杆菌中进行培养，所述农杆菌选择为农杆菌gv3101。

14、优选的，采用农杆菌介导法将重组质粒转入到金银花叶片中的方法为：

15、将培养好的农杆菌在室温下离心，弃掉废液，加入渗透培养基重悬菌体，室温下搅拌；

16、渗透培养基重悬后的农杆菌，注射到金银花叶片中。

17、优选的，取300ul菌液至30ml lb液体培养基中，于28℃、200rpm条件培养至od600＝0.6；

18、将培养好的农杆菌倒入50ml离心管中，室温8000rpm离心10min，弃掉废液，加渗透培养基重悬菌体至od600＝0.6，室温下搅拌2-3h；

19、渗透培养基重悬后的农杆菌，并注射到金银花叶片中，暗培养12-24小时后转正常培养，2天后取样。

20、技术效果：

21、将含有目的基因的重组质粒在金银花中表达，能够明显提高金银花叶片中绿原酸含量，相对于未处理的金银花，使得金银花叶片中绿原酸含量提高了。

技术特征：

1.一种提高金银花中绿原酸含量的重组基因，其特征在于，所述重组基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

2.如权利要求1所述提高金银花中绿原酸含量的重组基因编码的蛋白质。

3.如权利要求1所述提高金银花中绿原酸含量的重组基因的植物表达载体。

4.如权利要求1所述重组基因在提高金银花中绿原酸含量的应用。

5.如权利要求3所述植物表达载体在提高金银花中绿原酸含量的应用。

6.一种提高金银花中绿原酸含量的方法，其特征在于，所述方法包括：

7.如权利要求6所述提高金银花中绿原酸含量的方法，其特征在于，所述构建重组质粒的步骤为：

8.如权利要求7所述提高金银花中绿原酸含量的方法，其特征在于，将构建成功的重组质粒导入农杆菌中进行培养，所述农杆菌选择为农杆菌gv3101。

9.如权利要求8所述提高金银花中绿原酸含量的方法，其特征在于，采用农杆菌介导法将重组质粒转入到金银花叶片中的方法为：

10.如权利要求9所述提高金银花中绿原酸含量的方法，其特征在于，取300ul菌液至30ml lb液体培养基中，于28℃、200rpm条件培养至od600＝0.6；

技术总结本发明提供了一种提高金银花中绿原酸含量的重组基因及其应用，涉及生物医药领域，构建重组质粒，采用农杆菌介导法将重组质粒转入到金银花叶片中，进行培养，获得目的植株。提取金银花基因组DNA，基因组DNA为模板设计引物，在per‑miR319基因的上下游均引入上游引入Xbal酶切位点，下游引入Xmal酶切位点，利用高保真酶从DNA模板中扩增per‑miR319基因序列，回收扩增出来的含有per‑miR319基因的PCR产物；使用Xbal、Xmal内切酶将PBI121酶切成线性化载体，用同源重组法将per‑miR319基因与线性化PBI121载体连接，热激法将重组载体导入大肠杆菌DH5ɑ感受态，菌液PCR检测阳性菌落，提取阳性质粒，测序后获得含有目的基因的重组质粒。将含有目的基因的重组质粒在金银花中表达，明显提高金银花叶片中绿原酸含量。技术研发人员：杨丙贤,郑文茜,翁鑫莹,陈捷,阙若楠,岳治国,田旭,张琳受保护的技术使用者：浙江理工大学技术研发日：技术公布日：2024/9/9