一种重组蜂毒肽及其制备方法与流程

本发明属于基因工程，具体涉及一种重组蜂毒肽及其制备方法。

背景技术：

1、蜂毒肽是蜂毒的主要成分和主要生物活性物质，约占蜂毒干重的40%-50%，由26个氨基酸残基组成的多肽，分子式为c131h229n39o31，相对分子量为2846.46。蜂毒肽呈强碱性，易溶于水，且在蜂毒中起着主要的药理作用，是目前人类所知抗炎性最强的物质之一。蜂毒肽具有多种生物学、药理学和毒理学作用，包括对细胞膜的强表面活性作用、溶血、抗菌以及潜在的抗肿瘤作用。

2、目前提取蜂毒肽的主要方法有三种：化学合成、从粗蜂毒中分离纯化以及生物工程法。

3、化学合成方法可以获得具有生物活性的蜂毒肽纯品，现有技术中包括采用固相合成法合成蜂毒肽、通过截短序列法和置换氨基酸法对蜂毒肽的结构进行设计采用fmoc固相合成法合成蜂毒肽等，但由于这些合成方式成本较高，实际应用较少。

4、从粗蜂毒中分离纯化的方法是目前获得蜂毒肽纯品的主要途径。从粗蜂毒中获取蜂毒肽的困难主要源自两个方面:首先，蜂毒中包含多种碱性肽，蜂毒肽就是其中一种;其次，蜂毒肽在溶液中常以四聚体结构存在，这时它们的分子量与蜂毒中的磷脂酶a2（pla2）极为接近。纯化主要是应用色谱原理，多次通过柱分离，这种方法的操作步骤繁琐，而且产品中可能存在pla2等杂质。不断优化后，通过溶媒萃取、凝胶过滤柱层析、化学裂解和再次凝胶过滤柱层析四步纯化法成功从蜂毒中提取到蜂毒肽。现有技术还可以通过sephadexg-25分离纯化蜂毒肽的条件进行了优化，将获得的组分冻干后用乙醇沉淀即获得蜂毒肽半成品，再用反向液相色对纯化得到的半成品蜂毒肽进行了进一步的纯化，最后提取蜂毒肽。这种方法的优点是可以提高产量和纯度，但是操作复杂、步骤多、原料受到限制。

5、现有生物工程法则通过利用定向克隆技术将蜂毒肽基因转录到表达载体pesp-2中，在裂殖酵母schizosaccharomyces pombe中成功表达融合蛋白gst-melittin，通过gst亲和层析一步纯化得到融合蛋白。但在利用基因工程技术表达蜂毒肽基因时，由于蜂毒肽有对细胞膜的破坏性以及致死细胞毒性，多采用蛋白融合表达的方法克服蜂毒肽对宿主细胞的致死性，通过该方法获得蜂毒肽总体表达量水平低，纯化步骤繁琐。

6、化学合成方法获得蜂毒肽成本较高；从粗蜂毒中分离纯化的方法则是获得蜂毒肽纯品操作复杂，步骤多，原料受到限制；现有生物工程法则通过在工程菌中表达蜂毒肽再进行纯化获得蜂毒肽，总体表达量水平较低、纯化步骤繁琐。

7、同时蜂毒中有含有磷脂酶a2，其容易导致人体的致敏反应并与蜂毒肽分子量接近。

技术实现思路

1、本发明针对上述问题，提供了一种重组蜂毒肽及其制备方法。

2、为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种重组蜂毒肽，其特征在于，所述重组蜂毒肽的氨基酸序列如下：gigavllvattgapalkswikrkrqq。

3、一种重组蜂毒肽的制备方法，包括以下步骤：步骤一、构建重组蜂毒肽表达载体：设计并合成连接类弹性蛋白标签的蜂毒肽基因片段，并将其克隆至表达载体中，所述类弹性蛋白与蜂毒肽蛋白之间还包括柔性连接子，以大肠杆菌作为表达宿主，进行密码子优化，确定重组蜂毒肽的基因序列；然后合成基因序列并将合成基因序列以酶切位点ncoi和xhoi转入表达质粒pet28a(+)中,构建表达质粒pet28a-elp-pdt-4；

4、步骤二、原核表达：将构建好的重组蜂毒肽表达载体经一步化学法转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，筛选出含有质粒的转化子，挑取单菌落诱导培养，获得elp-pdt-4融合蛋白；

5、步骤三、纯化：利用itc法快速纯化elp-pdt-4融合蛋白，使用sephadex g-75柱进行二次纯化；

6、步骤四、溶血实验，验证elp-pdt-4融合蛋白功效。作为优选，所述步骤二中的宿主细胞为大肠杆菌宿主细胞。

7、作为优选，所述步骤一中的类弹性蛋白标签单元为vpgvg，重复40-80次。

8、作为优选，所述步骤一中的柔性连接子为gggs、ggggs、ggggsggggs或gggsgggs。

9、作为优选，所述步骤二中原核表达的方法为:取感受态细胞，加入质粒pet28a-elp-pdt-4的dna溶液5μl，轻弹摇匀后放置于冰上静置30分钟，在42℃水浴中进行短时间热激90秒，然后迅速置于冰上冷却5分钟，向热激后的感受态细胞中加入900μl的lb培养基，在37℃条件下振荡培养1小时，将复苏后的菌液4000rpm离心去除大部分培养基，然后涂布在含有kan抗性的lb固体平板上，筛选出含有质粒的转化子；挑取单菌落，接种于5 ml kan抗性的lb培养液中，过夜培养后按1:100扩大，培养至od600为0.5-0.6时，加入终浓度为0.5mmol/l的iptg 18℃诱导培养20小时；离心，收集菌液，每500ml培养液所得细菌沉淀以25ml pbs缓冲液重悬。

10、作为优选，所述离心的条件为4℃、5000×g，离心时间为10分钟。

11、作为优选，所述步骤三中利用itc法快速纯化elp-pdt-4融合蛋白步骤为：向重悬菌液中加入体积分数0．5%聚乙烯亚胺，冰上超声裂解细菌细胞30分钟，4℃，10,000×g条件下离心20分钟除去沉淀，收集上清液，上清液中加入na2co3至终浓度为0.5 mol/l，37℃水浴后离心收集沉淀，沉淀中加入预冷的磷酸盐缓冲溶液溶解并冰水浴15分钟，离心取上清液再加入na2co3至终浓度为1.0mol/l，37℃水浴、离心收集沉淀，再加入预冷的pbs溶解沉淀，冰水浴、离心收集上清液，将收集到的上清液用sephadex g-75柱分离二次纯化，洗脱的融合蛋白用3kd截留生物半透膜透析脱盐，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，并应用bca法进行蛋白定量。

12、作为优选，所述lb培养基成分为胰蛋白胨10 g/l、酵母提取物5 g/l、nacl 10 g/l，所述lb培养基的ph为7.0。

13、与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

14、相比现有技术，本发明的一种重组蜂毒肽及其制备方法，

15、(1)通过构建含有共表达类弹性蛋白标签的重组蜂毒肽表达载体，实现了重组蜂毒肽的高效表达；通过构建含有类弹性蛋白标签的重组蜂毒肽表达载体、使用大肠杆菌作为表达宿主，进行密码子优化，并通过一步化学化法转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，实现高效表达，提高了蜂毒肽的表达量和纯度；

16、(2)本发明通过热循环的方法简化了纯化流程，一步柱纯化即可获得高纯度的重组蜂毒肽，提高了生产效率；通过使用sephadex g-75柱进行二次纯化，进一步提高了重组蜂毒肽的纯度；

17、(3)本发明通过溶血实验评估了其安全性，为蜂毒肽在医疗、药物开发、化妆品、农业、生物制药、科研以及环境保护等多个领域的应用提供了新的思路和方法。