一种多酶级联转化L-酪氨酸生产酪醇和红景天苷的方法

本发明涉及生物工程，尤其是指一种多酶级联转化l-酪氨酸生产酪醇和红景天苷的方法。

背景技术：

1、酪醇(tyrosol)是一种具有药理活性的酚类化合物，是苯乙醇的一种衍生物，是一种单酚类抗氧化剂，有多种天然来源，如橄榄油和绿茶等。酪醇具有很多生理活性功能，如抗氧化、抗疲劳、抗缺氧、抗应激、抗寒冷、镇静、心血管疾病、高血压等。酪醇还可以作为酒类的调味剂，在提升酒类饮料的口感中起着重要的作用，尤其是在清酒、啤酒和葡萄酒中。

2、随着酪醇生理活性的开发以及市场需求量的提高，开发高效的酪醇生产途径已经成为研究的热点。目前酪醇的制备方法主要包括天然提取法、化学合成法、生物合成法。天然提取法获取酪醇提取难度大、过程复杂，化学合成法在实际生产中也存在反应条件严格、成本高昂和反应过程会产生大量污染等问题，两种方法都不利于酪醇的工业化生产。以大肠杆菌作为底盘细胞，从酪氨酸出发合成酪醇的生物合成途径主要有三条(图1)，分别是：(1)tdc-tyo途径，酪氨酸首先在酪氨酸脱羧酶(tdc)的作用下转化为酪胺，再由酪胺氧化酶(tyo)催化生成对羟基苯乙醛，最后被乙醇脱氢酶还原生成酪醇；(2)丙酮酸脱羧途径，酪氨酸在芳香族氨基酸氨基转移酶的作用下生成对羟基苯丙酮酸，对羟基苯丙酮酸进一步被丙酮酸脱羧酶催化生成对羟基苯乙醛，最后被乙醇脱氢酶还原生成酪醇；(3)aas途径，该途径中酪氨酸直接在芳香醛合酶(aas)催化下生成对羟基苯乙醛，再被乙醇脱氢酶还原生成酪醇。

3、红景天是生长在高寒无污染地带的珍稀野生植物，是我国藏族人民的习用药物，至今已有1000多年的应用历史，具有刺激神经系统、增加工作效率、消除疲劳和预防高山症等作用。除此之外，红景天还具有保护心脑血管，神经细胞以及抗肿瘤抗辐射等功能。红景天的主要药用活性成分是红景天苷及其苷元酪醇。目前红景天苷的主要提取方式有天然提取法、化学合成法、生物合成法三种。天然提取法在现阶段面临原材料价格昂贵、提取效率低、能耗大、损害生产人员的健康是天然提取的主要问题，仍然无法很好适应大规模的生产。尽管化学合成红景天苷的纯度较高，但有机试剂残留与废液的处理导致难以保障生产过程的安全性。因此利用生物合成法生产红景天苷是目前的研究热点。

4、糖基转移酶(glycosyltransferase)类(ec2.4.x.y)是在糖基与受体生成特定的糖苷键进行连接的一类酶，在生物体中普遍存在。糖基转移酶以核苷二磷酸活化的含糖基化合物作为糖基供体，其中利用尿苷二磷酸葡萄糖作为糖基供体的糖基转移酶最为常见，全称为udp葡萄糖基转移酶(udp-glucosyltransferases，ugts)利用糖基转移酶实现天然产物的糖基化，有利于提高物质的生物活性，更有利于投入到医疗、保健、美容等领域的应用，解决天然途径获取糖苷类产物无法满足需求的问题。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种多酶级联转化l-酪氨酸生产酪醇和红景天苷的方法。为了得到一种高效合成酪醇和红景天苷的方法，本发明构建了以大肠杆菌为宿主的共表达工程菌，实现了以l-酪氨酸为底物进行酪醇和红景天苷的高效生产。

2、本发明通过在大肠杆菌细胞中表达合成酪醇和红景天苷的路径酶：酪氨酸脱羧酶、酪胺氧化酶、糖基转移酶，实现了酪醇和红景天苷的高效生产，为酪醇和红景天苷的工业化生产奠定了基础。

3、本发明通过以下技术方案实现：

4、本发明第一个目的是提供一种生产酪醇和红景天苷的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌为双质粒表达系统表达糖基转移酶、酪氨酸脱羧酶和酪胺氧化酶。

5、在本发明的一种实施方式中，所述双质粒包括petduet-1质粒和pacycduet-1质粒。

6、在本发明的一种实施例中，所述糖基转移酶位于petduet-1质粒上，用petduet-1质粒表达三个拷贝的糖基转移酶基因；所述酪氨酸脱羧酶和酪胺氧化酶位于pacycduet-1质粒上。

7、在本发明的一种实施例中，所述糖基转移酶来源于红景天(rhodiola rosea)，氨基酸序列如seq id no.3所示；所述酪氨酸脱羧酶来源于粪肠球菌(enterococcusfaecalis)，氨基酸序列如seq id no.5所示；所述酪胺氧化酶来源于藤黄微球菌(micrococcusluteus)，氨基酸序列如seq id no.7所示；所述糖基转移酶是将氨基酸序列如seq id no.1所示野生糖基转移酶的第158位苏氨酸突变为丙氨酸，并将第311位酪氨酸突变为丙氨酸得到。

8、在本发明的一种实施例中，所述大肠杆菌为escherichiacolibl21(de3)。

9、本发明第二个目的是提供一种全细胞催化剂，含有所述重组大肠杆菌。

10、本发明第三个目的是提供所述重组大肠杆菌或所述全细胞催化剂在制备酪醇和红景天苷中的应用。

11、本发明第四个目的是提供一种生产酪醇和红景天苷的方法，包括以下步骤：以l-酪氨酸为底物，采用所述重组大肠杆菌或所述全细胞催化剂为催化剂，催化生产酪醇和红景天苷。

12、在本发明的一种实施例中，所述催化生产的温度为20℃～30℃；时间为48h～50h；菌体od600为30；ph值为7.0～8.0。

13、在本发明的一种实施例中，所述l-酪氨酸的浓度为20g·l-1～30g·l-1。

14、在本发明的一种实施例中，所述催化的反应体系还包括30mmol·l-1～40mmol·l-1的udpg。

15、本发明中野生型ugt33的核苷酸序列如seq id no.1所示，氨基酸序列如seq idno.2所示，为了提高糖基转移酶的催化效率，将野生型ugt33的氨基酸序列的第158位苏氨酸及第311位酪氨酸均突变为丙氨酸，得到突变后的糖基转移酶，氨基酸序列为seq idno.3所述。

16、本发明的有益效果：

17、本发明提供了一种多酶级联转化l-酪氨酸生产酪醇和红景天苷的方法(转化途径如图1所示)。本发明构建了一种大肠杆菌重组菌，用于全细胞催化生产酪醇和红景天苷。该大肠杆菌重组菌同时表达三种酶，分别为糖基转移酶、酪氨酸脱羧酶、酪胺氧化酶，本发明所述的生产方法通过模块化组装和基因重复表达实现各酶的平衡表达，避免副产物的积累，实现了以l-酪氨酸为底物高效合成酪醇和红景天苷。

技术特征：

1.一种生产酪醇和红景天苷的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌为双质粒表达系统表达糖基转移酶、酪氨酸脱羧酶和酪胺氧化酶。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述糖基转移酶位于petduet-1质粒上，用petduet-1质粒表达三个拷贝的糖基转移酶基因；所述酪氨酸脱羧酶和酪胺氧化酶位于pacycduet-1质粒上。

3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述糖基转移酶的氨基酸序列如seq id no.3所示；所述酪氨酸脱羧酶的氨基酸序列如seq id no.5所示；所述酪胺氧化酶的氨基酸序列如seq id no.7所示；

4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌为escherichiacolibl21(de3)。

5.一种全细胞催化剂，其特征在于，含有权利要求1-4任一项所述重组大肠杆菌。

6.权利要求1-4任一项所述重组大肠杆菌或权利要求5所述全细胞催化剂在制备酪醇和红景天苷中的应用。

7.一种生产酪醇和红景天苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：以l-酪氨酸为底物，采用权利要求1-4任一项所述重组大肠杆菌或权利要求5所述全细胞催化剂为催化剂，催化生产酪醇和红景天苷。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述催化生产的温度为20℃～30℃；时间为48h～50h；ph值为7.0～8.0。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述l-酪氨酸的浓度为20g·l-1～30g·l-1。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述催化的反应体系还包括30mmol·l-1～40mmol·l-1的udpg。

技术总结本发明涉及一种多酶级联转化L‑酪氨酸生产酪醇和红景天苷的方法，属于生物工程技术领域。本发明首先将野生糖基转移酶的第158位苏氨酸突变为丙氨酸，并将第311位酪氨酸突变为丙氨酸，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的糖基转移酶。然后构建了以大肠杆菌为宿主的共表达工程菌，通过双质粒表达系统表达糖基转移酶、酪氨酸脱羧酶和酪胺氧化酶，实现了以L‑酪氨酸为底物进行酪醇和红景天苷的高效生产。本发明的生产方法通过模块化组装和基因重复表达实现各酶的平衡表达，避免副产物的积累，实现了以L‑酪氨酸为底物高效合成酪醇和红景天苷，为酪醇和红景天苷的工业化生产奠定了基础。技术研发人员：徐美娟,饶志明,熊艺哲,魏晨昱,张显受保护的技术使用者：江南大学技术研发日：技术公布日：2024/9/9