一种工业化一罐式养殖雨生红球藻的方法与流程

本发明涉及微藻生物养殖，具体为一种工业化一罐式养殖雨生红球藻的方法。

背景技术：

1、虾青素(astaxanthin)，又名虾黄质、龙虾壳色素，呈粉红色，是一种酮式类胡萝卜素，化学结构类似于β-胡萝卜素，在自然界中具有极强的抗氧化性；天然虾青素是人类迄今为止发现自然界中最强的抗氧化剂，其抗氧化活性远远超过现有抗氧化剂，被誉为“超级氧化剂”；其清除自由基的能力是：虾青素是维生素c的功效的6000倍；是维生素e的1000倍；是辅酶q10的800倍；是一氧化氮的1800倍；是纳豆的3100倍；是花青素的700倍；是β-胡萝卜素功效的100倍；是番茄红素功效的10倍；是叶黄素功效的200倍；是茶多酚功效的320倍；其有效清除细胞内的氧自由基，增强细胞再生能力，维持机体平衡和减少衰老细胞的堆积，由内而外保护细胞和dna健康，从而保护皮肤健康，促进毛发生长，抗衰老、缓解运动疲劳、增强活力；自2008年以来，国内外大量研究证实虾青素具有较强的抗氧化活性，在提高免疫力，预防肿瘤、心血管疾病、糖尿病等慢性疾病的发生发展，延缓衰老等方面具有积极的促进作用；

2、雨生红球藻(haematococcus pluvialis)，是一种单细胞绿藻，其细胞内累积的虾青素占类胡萝卜素总量的90％以上，含量可达到藻体干重的4％以上，是天然虾青素最为重要的来源；雨生红球藻增殖依赖于细胞的分裂，当环境适宜时，其生物量不断增加，属于绿色游动细胞阶段；当受到外界环境胁迫时，如光照、温度、ph值变化和化学诱导剂的加入等，自身可形成孢子，逐步累积虾青素和油脂，藻细胞变成红色，属于红色细胞积累虾青素阶段；

3、虽然，雨生红球藻被公认为自然界中虾青素含量最高、最可能实现工业化生产的物种，然而，因其生长速度慢、周期长、虾青素含量和产率低，培养过程中易受细菌、杂藻及原生动物污染等不利因素的影响，制约了其工业化生产的发展，本领域技术人员探索将绿色游动细胞的快速生产阶段和不动孢子积累虾青素阶段的养殖集中到一个反应器中进行，简化养殖设备和人工操作，缩短养殖时间，减少不同阶段交接过程中藻类的死亡，提高养殖效率和产量；

4、专利cn02138827.x公开了一种培养雨生红球藻生产虾青素的方法，包括培养基配方、一步法生产工艺、培养基的循环使用和用二氧化碳调节培养液ph值诱导红球藻孢子的形成和虾青素积累的方法；雨生红球藻的营养细胞的生长、孢子转化和虾青素累积是在同一个光生物反应器、同一培养基中完成，通过调控培养液的ph值促进孢子转化和虾青素累积，培养周期为12-15天；培养基经过回收—处理—重新配制，可以循环使用至少6次；孢子中虾青素含量为2-3％；雨生红球藻在绿色游动细胞的快速生产阶段和不动孢子积累虾青素阶段的生长特点不同，该方法中没有对两个阶段的过渡进行有效处理，细胞死亡率仍然较高，因此最后虾青素的生产效率不高；

5、现有技术对于一步法养殖雨生红球藻的研究较少，对于养殖条件的探索和在提高虾青素含量的同时，减少过渡阶段藻类细胞的死亡的研究还处于起步阶段；目前，主要使用高光、高盐或诱导剂的条件，使得雨生红球藻从绿色游动细胞阶段进入红色细胞积累虾青素阶段，进而积累虾青素，这个过程容易造成藻类不适应变化的环境而大量死亡，影响产品中的虾青素含量；然而，采用比较温和的缺氮缺磷方法，再配合其它养殖条件的改变，一直是本领域面临的难题；尤其是大规模工业化养殖雨生红球藻的应用中，一罐式雨生红球藻的养殖方法还很不成熟，因此，有必要提供一种工业化一罐式养殖雨生红球藻的方法解决上述技术问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种工业化一罐式养殖雨生红球藻的方法，以解决上述背景技术中提出的现有技术使用高光、高盐或诱导剂的条件，使得雨生红球藻从绿色游动细胞阶段进入红色细胞积累虾青素阶段，进而积累虾青素，这个过程容易造成藻类不适应变化的环境而大量死亡，影响产品中的虾青素含量的问题，本发明技术方案针对现有技术解决方案过于单一的技术问题，提供了显著不同于现有技术的解决方案。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种工业化一罐式养殖雨生红球藻的方法，包括以下步骤：

3、(1)藻种选育：采用平板法或稀释培养法培养藻种，选择死亡率低、适合积累虾青素且产量高的藻种，将藻种进行扩增培养；

4、(2)配置培养液：配制营养盐，营养盐按照以下方案分别配置为营养盐母液：硝酸钠100g/l，无水磷酸氢二钾75g/l，无水磷酸二氢钾75g/l，硼酸11.4g/l，氯化钠25g/l，无水硫酸镁37g/l，七水合硫酸亚铁4.98g/l，七水合硫酸锌8.82g/l，四水合氯化锰1.44g/l，二水合钼酸钠1.2g/l，五水合硫酸铜1.57g/l，六水合硝酸钴0.49g/l，乙二胺四乙酸二钠50g/l，氢氧化钾31g/l，结晶氯化钙25g/l；

5、(3)接种：将步骤(2)的培养液分别灭菌后，按照比例加入装有纯水的光生物反应器中，调制成雨生红球藻培养基，然后将步骤(1)得到的经过扩增培养的雨生红球藻藻种接种到所述光生物反应器中；

6、(4)绿色游动细胞阶段培养：所述光生物反应器中设有防水led灯，按照每1升培养液对应光能强度为1500-2000lux来设置光照参数，培养温度调整为20-26℃，培养液ph值调整为6.8-7.5，通过通气导管通入无菌空气与二氧化碳的混合气体，通气流量按照每1000升培养液90l/min设置，空气与二氧化碳混合比值为100:1；培养周期设置为3-5d；

7、(5)红色细胞积累虾青素阶段培养：绿色游动细胞阶段培养完成后，培养液颜色呈墨绿色，进入虾青素的积累阶段，led灯调整为每1升培养液对应光照强度为4500-5500lux，培养温度调整为27-30℃，培养液ph调整为值为8-9，只通入无菌空气，通气流量按照每1000升培养液90l/min设置，并增加碳源营养盐，养殖周期为10-15d；

8、(6)采收：当结束红色细胞积累虾青素阶段培养后，雨生红球藻的培养液深红色时，关闭led灯，停止通入无菌空气，培养液静置沉降约8h后，使用分离机进行藻液分离，获取其中的雨生红球藻细胞，完成采收作业，上述整个培养周期都在同一个光生物反应器内完成。

9、2、根据权利要求1所述的一种工业化一罐式养殖雨生红球藻的方法，其特征在于，步骤(1)中符合条件的藻种品系的评判标准为：

10、(1)在同样条件下，细胞分裂旺盛，接种后可快速进入对数期生长；

11、(2)细胞抗逆性高时，细胞培养条件变化敏感，当培养条件改变时，细胞不易死亡，而且可快速进行保护性和培养环境的适应，开始累积虾青素；

12、(3)细胞内色素体饱满，大小适中，所述大小适中的细胞平均直径为23-26μm；经过诱导后可以在细胞干重上达到0.65g/l以上、虾青素含量占干重4％以上。

13、3、根据权利要求1所述的一种工业化一罐式养殖雨生红球藻的方法，其特征在于，所述步骤(2)中配置的培养液中的硝酸钠作为主要的氮源营养盐，硝酸钠的含量为0.1-0.2g/l。

14、4、根据权利要求1所述的一种工业化一罐式养殖雨生红球藻的方法，其特征在于，步骤(2)中所述营养液添加比例中，除硝酸钠调制浓度为0.1-0.2g/l，其他成分调制浓度按照以下数值范围添加：

15、

16、

17、4、根据权利要求1所述的一种工业化一罐式养殖雨生红球藻的方法，其特征在于，步骤(3)中所述接种密度为1.0×104-5.0×104cells/ml。

18、5、根据权利要求1所述的一种工业化一罐式养殖雨生红球藻的方法，其特征在于，步骤(5)中增加的碳源营养盐为碳酸氢钠，添加比例为0.12-0.15g/l。

19、6、根据权利要求1所述的一种工业化一罐式养殖雨生红球藻的方法，其特征在于，在步骤(4)(5)中对led灯进行调节，led灯的特征为包括波长分别为300-400nm、400-500nm、600-700nm的三个特征峰，三个特征峰的光强比为(0-100)：(0-100)：(0-100)

20、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

21、1、本发明，采用一罐式养殖雨生红球藻的方法，使得整个培养周期和生产过程都在同一个密闭的光生物反应器中进行，从而使得生产稳定且对外部环境无依赖，通过对不同范围培养阶段的温度、ph值和光照条件限定，可以实现自动化精确控制，与传统的分段式养殖方法相比，保证了工业化生产中工艺的稳定性和最大程度地降低了由人为因素带来的不确定性，并且不依赖自然光照，可以在任何地方、任何季节进行养殖，使得整个培养和生产过程的工艺简单，省去独立的绿色游动细胞阶段，减少了不同培养阶段之间的转运操作，节约了设备、人工成本与能耗，降低了污染机会以及由于操作环节多而引起的不确定因素的风险；

22、2、本发明通过对接种密度值范围限定的条件下，使得藻种使用量少，从而使得藻种细胞活力较高，避免了由于藻种培养周期过长而导致老化、难以快速进入细胞分裂等问题，同时由于藻种用量小，藻种不需要经过中间容器的扩增，直接使用玻璃烧瓶培养就能够实现，而烧瓶培养属于实验室安全等级较高且最容易实现的，还可以通过高温高压灭菌，将接种前期的污染机会降到最低，有利于保证后续养殖，与现有的技术相比，通过对接种密度值的范围限定条件下，再配合培养液中各组分的浓度，尤其是硝酸盐的浓度，以及光生物反应器的培养环境，藻细胞能够获得较快的生产速度，对藻种较低的初始接种密度，为其生产提供了充足的生长空间、光照条件、营养供给和较低的代谢物浓度，有利于藻细胞快速增殖；

23、3、本发明，通过对硝酸钠的含量范围限定配置的培养液，再配合选育出来的藻种，能够实现到红色细胞积累虾青素阶段之前，培养液中的硝酸钠刚好被藻细胞基本消耗完毕，从而有效使得硝酸钠的含量既不影响藻细胞在绿色游动细胞阶段进行快速分裂所需的营养，又不会在培养液里剩余，且当藻细胞达到一定密度和大小时，此时检测培养液刚好处于缺氮状态，进而以利于藻细胞迅速进入红色细胞积累虾青素阶段，并在缺氮条件下继续增大，最终得到足够的生物量，与现有的技术方案相比，这种方法只需要控制培养液配方含量，即可实现绿色游动细胞阶段与红色细胞积累虾青素阶段之间的缺氮诱导，操作简便，大大降低了藻细胞的死亡率，提高了培养效率和产量；

24、4、本发明采用了特定的波长、功率可调的led灯，便于了在雨生红球藻生产虾青素的不同阶段，对其光照条件进行调节；同时在绿色细胞培育结束，红色细胞积累虾青素阶段之前，进行紫外光照射，在充分灭菌的同时并不会对藻类细胞产生杀伤，进一步增强了雨生红球藻进入红色细胞积累虾青素阶段的存活率；

25、综上所述，通过控制培养液中的氮源营养盐和碳源营养盐的含量，为藻细胞提供缺氮环境和充足的其它营养环境，提供较为温和的培养条件转变环境，提高藻细胞的适应性，再与光照条件的改变相配合，完成藻细胞的平稳过渡，与现有的技术相比，有效的使得不同培养阶段过渡期的藻细胞死亡率降低，使得藻细胞的虾青素含量较高，达到4％以上，细胞干重不低于0.65g/l，同时培养周期较短。