一种构建原发性开角型青光眼非人灵长类动物模型的方法与流程

本发明属于动物模型构建，特别涉及一种构建原发性开角型青光眼非人灵长类动物模型的方法。

背景技术：

1、青光眼是由视网膜神经节细胞的凋亡导致视觉损失的一类眼科疾病，是仅次于白内障的第二位的致盲性眼病。2010年全球青光眼患者约为6050万，其中，约840万患者失明。

2、青光眼主要分为原发性开角型青光眼(primary open-angle glaucoma,poag)和原发性闭角型青光眼(primary angle-closure glaucoma,pacg)。全球流行病学统计数据表明，原发性开角型青光眼为青光眼的主要类型。

3、小梁网(trabecular meshwork,tm)的生理作用是通过调节房水(aqueous humor,ah)流出来维持正常的眼内压。随着年龄的增长，驻留在tm内的细胞数量显著减少，导致ah外流减少，眼压(intraocular pressure,iop)升高，最终导致细胞应激、功能障碍和视网膜神经节细胞死亡，从而丧失视力。这也正是原发性开角型青光眼重要的致病因素之一。

4、在众多致病因素中，tm功能障碍的一个关键风险因素是基因突变，比如myoc基因突变，从而导致高眼压。myoc基因又称小梁网诱导糖皮质激素反应蛋白基因，定位于染色体1q24.3-q25.2，其总长度约为17kb。myoc基因是与poag成因有关的基因，其蛋白产物myocilin蛋白是一种分泌型糖蛋白，是含有504个氨基酸的糖蛋白。眼组织中，小梁网myocilin蛋白表达水平最高且在细胞内外均可检测到。细胞内的myocilin蛋白由小梁网细胞以外泌体样囊泡形式释放至细胞外，突变时分泌受阻并异常聚集，使细胞致敏诱发凋亡。细胞外myocilin蛋白通过与一种或多种细胞外基质蛋白相互作用，影响细胞的形态、粘接和迁移活动，调节细胞外基质的成分和结构，从而影响房水流出系统。越来越多的研究表明，myoc基因变异具有多样性，目前有70多个myoc基因突变已被发现与poag致病有关。

5、目前，多种病毒载体已应用于眼科疾病的基因治疗研究并取得较好成果，常用的病毒载体有腺病毒载体(adenovirus vector,adv)、慢病毒载体(lentiviral vector,lv)、腺相关病毒载体(adeno-associated virus vector,aav)。腺病毒载体具有瞬时表达的特点，在减轻角膜移植免疫反应等领域发挥重要作用；慢病毒载体具有稳定高效的特点，在体内可长期缓慢表达；腺相关病毒载体具有免疫原性低，精准持久等特点，可感染多种视网膜细胞，其与crispr/cas9联合使用，为眼科遗传疾病的精准治疗提供了新的思路。

6、中国专利文献cn111850044a(申请号202010685115.4)以最广泛的rp致病基因rho为例，设计并实现了利用crispr基因编辑系统与腺相关病毒载体aav转导系统，通过视网膜下腔注射高效感染感光细胞，直接在成年猕猴视网膜感光细胞中敲除rho基因，以模拟遗传性rho突变引起的视网膜变性退化，在3-6个月的时间构建猕猴视网膜色素变性(rp)动物模型。中国专利文献cn115725659a(申请号202211017613.7)采用aav8-efs-sacas9-rdh 12-sgrna1病毒和aav8-efs-sacas9-rdh12-sgrna2病毒通过视网膜下腔注射于恒河猴的视网膜下腔，恒河猴的视网膜出现视网膜色素变动，椭圆体带模糊、消失、细胞排列紊乱，视网膜厚度变薄，erg暗反应波形振幅降低等类似先天性黑矇的临床表现，说明应用视网膜原位基因剪切方法成功构建了非人灵长类动物先天性黑矇模型，模拟了与人相同的视网膜细胞损伤及凋亡造成的视杆细胞功能障碍。兰芬等人研究比较了腺病毒载体与慢病毒载体分别介导增强型绿色荧光蛋白对体外培养的兔角膜基质细胞的转染效率，探讨较优一种病毒载体作为角膜基因治疗载体的可行性，发现腺病毒载体与慢病毒载体均可有效感染兔角膜基质细胞(兰芬等，腺病毒与慢病毒载体转染离体兔角膜基质细胞的有效性对比研究，眼科新进展，2012,32(2):123-126.)。另外，多篇文章报道，利用病毒载体递送myocy437h突变基因于小鼠会导致其眼压明显上升，但在现有技术中，具体何种病毒载体可以成功在灵长类动物体内利用myocy437h突变基因来升高眼压、构建青光眼模型还不明确。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种构建原发性开角型青光眼非人灵长类动物模型的方法，是以plent-ef1a-3flag-cmv-copgfp-p2a-puro为慢病毒载体构建含有myocy437h突变基因的重组慢病毒，将所述重组慢病毒通过前房注射的方式构建获得原发性开角型青光眼非人灵长类动物模型。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种构建原发性开角型青光眼非人灵长类动物模型的方法，是利用慢病毒递送myocy437h突变基因，诱导非人灵长类动物形成原发性开角型青光眼动物模型。

4、根据本发明优选的，所述慢病毒的载体为plent-ef1a-3flag-cmv-copgfp-p2a-puro。

5、根据本发明优选的，所述myocy437h突变基因的核苷酸序列为seq id no.1所示。

6、根据本发明优选的，所述非人灵长类动物为新大陆猴或旧大陆猴；进一步优选的，所述旧大陆猴为猕猴；进一步优选的，所述猕猴为恒河猴、熊猴、短尾猴、台湾岩猴或平顶猴。

7、根据本发明优选的，所述方法是向非人灵长类动物眼部的前房部位注射包载myocy437h突变基因的重组慢病毒，从而诱导形成原发性开角型青光眼动物模型。

8、进一步优选的，所述包载myocy437h突变基因的重组慢病毒是指携带myocy437h突变基因的重组慢病毒，其注射剂量为8.8×106～2.75×107tu/眼。

9、进一步优选的，诱导形成原发性开角型青光眼动物模型时，间隔注射重组慢病毒，间隔时间为6-7周。

10、一种按照上述方法构建得到的原发性开角型青光眼非人灵长类动物模型。

11、上述原发性开角型青光眼非人灵长类动物模型在筛选治疗原发性开角型青光眼的药物中的应用。

12、上述原发性开角型青光眼非人灵长类动物模型在研究原发性开角型青光眼病理机制中的应用。

13、包载myocy437h突变基因的重组慢病毒在构建原发性开角型青光眼非人灵长类动物模型中的应用。

14、根据本发明优选的，所述重组慢病毒的载体为plent-ef1a-3flag-cmv-copgfp-p2a-puro。

15、有益效果：

16、1、本发明首次发现利用以plent-ef1a-3flag-cmv-copgfp-p2a-puro为慢病毒载体包载myocy437h突变基因的重组慢病毒，可以提高恒河猴眼压，从而成功诱导恒河猴原发性开角型青光眼模型，为原发性开角型青光眼的研究提供新的突变基因诱导模型，也为递送myocy437h突变基因于非人灵长类动物眼中，发现新的合适的递送慢病毒载体；而包载myocy437h突变基因的重组腺病毒则无法提高恒河猴眼压，进而不可以诱导恒河猴原发性开角型青光眼模型。

17、2、本发明为后续建立灵长类动物原发性开角型青光眼模型及为探讨原发性开角型青光眼发病机制奠定了基础。