一种抗灰霉Rpl1蛋白的抗体及应用

本发明涉及生物，更具体的说是涉及一种抗灰霉rpl1蛋白的抗体及应用。

背景技术：

1、灰霉菌(botrytis cinerea)为灰霉病的病原，抗性强，侵染葡萄等农作物后造成品质下降，减产，甚至绝收。目前，针对灰霉主要的检测方法，一种是病原学的检测；另一种是核酸检测。前一种方法的弊端在于，检测出灰霉时，植株已经被侵染，损失不可避免。后一种方法优点是检测精度高且快速，适用于土壤、种子、植株组织等样品，然而该方法需要专用仪器设备进行检测，且操作者需要专业训练后方能操作。

2、因此，建立一种能针对灰霉菌核、分生孢子及菌丝体分布及传播特点的快速而准确检测方法，能在灰霉病爆发前进行检测以提前预防控制，可防止灰霉大面积爆发造成损失，是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种抗灰霉rpl1蛋白的抗体及应用。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种检测灰霉病原菌的抗体，以灰霉rpl1蛋白作为抗原免疫动物所得。

4、灰霉rpl1蛋白参与蛋白生物合成，对于灰霉不可或缺，序列特异且保守，能有效表征灰霉。本发明利用rpl1蛋白作为抗原制备的抗体，利用该抗体结合彩色免疫微球标记和免疫印迹等技术可特异地从土壤、种子、植株组织等样品中检测到灰霉，对于灰霉病的早期诊断具有极大优势。且该方法为血清学检测方法，不需要昂贵的仪器设备，普通技术人员即可操作，具有简便、快速、灵敏地特点。

5、作为优选的技术方案，所述灰霉rpl1蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

6、本发明的另一目的是，提供上述检测灰霉病原菌的抗体的制备方法，包括构建或合成含有灰霉rpl1蛋白的重组质粒，克隆表达灰霉rpl1蛋白，纯化得灰霉rpl1蛋白，将纯化后的灰霉rpl1蛋白作为抗原免疫动物，所得免疫血清即为检测灰霉病原菌的抗体。

7、作为优选的技术方案，构建或合成含有灰霉rpl1蛋白的重组质粒中的质粒为pet24a。

8、本发明的另一目的是，提供一种检测灰霉病原菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述检测灰霉病原菌的抗体，或者包括上述制备方法制备的抗体。

9、作为优选的技术方案，所述试剂盒为免疫印迹试剂盒，还包括硝酸纤维素印迹膜、hrp标记的二抗，洗涤液pbs，以及ecl化学发光试剂。

10、作为优选的技术方案，所述试剂盒为彩色免疫微球试剂盒，还包括硝酸纤维素印迹膜、洗涤液pbs，且rpl1抗体用彩色免疫微球标记。

11、本发明的另一目的是，提供上述检测灰霉病原菌的抗体或者上述制备方法制备的抗体或者上述试剂盒在制备检测灰霉病原菌产品中的应用。

12、本发明的另一目的是，提供一种灰霉病原菌的免疫检测方法，包括以下步骤：

13、(1)将硝酸纤维素印迹膜隔着保护膜划出1×1cm的方格，然后去掉保护膜，并吸取待检测样品溶液2μl点在方格中；置于湿盒中，提前垫有pbs缓冲液润湿过的滤纸，于37℃孵育2h；

14、(2)将孵育好的硝酸纤维素印迹膜转移到无蛋白封闭液中进行封闭，于37℃封闭2h，然后用稀释为1×的pbst洗涤，放置在脱色摇床上洗3次，转速为40rpm，每次洗涤5min；

15、(3)将孵育好的硝酸纤维素印迹膜分别转移到提前用pbs稀释成1万倍的上述检测灰霉病原菌的抗体中，于37℃孵育2h，然后用稀释为1×的pbst洗涤，放置在脱色摇床上洗3次，转速为40rpm，每次洗涤5min；

16、(4)将洗涤好的硝酸纤维素印迹膜取出并按稀释度做好标记，转移到稀释为5000倍的hrp标记羊抗兔二抗中，于37℃孵育结合2h，然后用稀释为1×的pbst洗涤，放置在脱色摇床上洗4次，转速为40rpm，每次洗涤5min；

17、(5)用超灵敏ecl化学发光试剂显色，读取结果。

18、本发明的另一目的是，提供一种灰霉病原菌的免疫微球检测方法，包括以下步骤：

19、(1)制备蓝色免疫微球，取直径1μm的nhs标记的蓝色微球10ml，按质量比0.1‰加入上述检测灰霉病原菌的抗体10μl进行交联，25℃下避光交联10h，转速为40rpm；交联完毕加入2m tris250μl至终浓度为50mm进行封闭，25℃下避光封闭10h，转速为40rpm；

20、(2)将硝酸纤维素印迹膜隔着保护膜划出1×1cm的方格，然后去掉保护膜，并吸取待检测样品溶液2μl点在方格中；置于湿盒中，提前垫有pbs缓冲液润湿过的滤纸，于37℃孵育2h；

21、(3)将孵育好的硝酸纤维素印迹膜转移到无蛋白封闭液中进行封闭，于37℃封闭2h，然后用稀释为1×的pbst洗涤，放置在脱色摇床上洗3次，转速为40rpm，每次洗涤5min，洗涤过程中要防止膜粘到没有缓冲液的壁上；

22、(4)将制备好的蓝色免疫微球滴加在孵育好的硝酸纤维素印迹膜上，均匀覆盖表面；于25℃孵育10min，然后用稀释为1×的pbst洗涤，放置在脱色摇床上洗3次，转速为40rpm，每次洗涤2min，洗涤后显色读取结果。

23、有益效果：本发明基于抗原与抗体特异性结合特点，通过免疫印迹和免疫微球技术对灰霉rpl1蛋白进行检测。本发明克服了传统检测灰霉时间长、要求高的弊端，将灰霉病的检测时间大大提前，实现对灰霉早期、快速而准确的检测效果。

技术特征：

1.一种检测灰霉病原菌的抗体，其特征在于，以灰霉rpl1蛋白作为抗原免疫动物所得。

2.根据权利要求1所述的检测灰霉病原菌的抗体，其特征在于，所述灰霉rpl1蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

3.如权利要求1或2所述检测灰霉病原菌的抗体的制备方法，其特征在于，构建或合成含有灰霉rpl1蛋白的重组质粒，克隆表达灰霉rpl1蛋白，纯化得灰霉rpl1蛋白，将纯化后的灰霉rpl1蛋白作为抗原免疫动物，所得免疫血清即为检测灰霉病原菌的抗体。

4.根据权利要求3所述的检测灰霉病原菌的抗体的制备方法，其特征在于，构建或合成含有灰霉rpl1蛋白的重组质粒中的质粒为pet24a。

5.一种检测灰霉病原菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述检测灰霉病原菌的抗体，或者包括权利要求3或4所述制备方法制备的抗体。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为免疫印迹试剂盒，还包括硝酸纤维素印迹膜、hrp标记的二抗，洗涤液pbs，以及ecl化学发光试剂。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为彩色免疫微球试剂盒，还包括硝酸纤维素印迹膜、洗涤液pbs，且rpl1抗体用彩色免疫微球标记。

8.如权利要求1或2所述检测灰霉病原菌的抗体或者权利要求3或4所述制备方法制备的抗体或者权利要求5-7任一所述试剂盒在制备检测灰霉病原菌产品中的应用。

9.一种灰霉病原菌的免疫检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

10.一种灰霉病原菌的免疫微球检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

技术总结本发明公开了一种抗灰霉Rpl1蛋白的抗体及应用，涉及生物技术领域。本发明检测灰霉病原菌的抗体，是以灰霉Rpl1蛋白作为抗原免疫动物所得，所述灰霉Rpl1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明基于抗原与抗体特异性结合特点，通过免疫印迹和免疫微球技术对灰霉Rpl1蛋白进行检测，克服了传统检测灰霉时间长、要求高的弊端，将灰霉病的检测时间大大提前，实现对灰霉早期、快速而准确的检测效果。技术研发人员：李艳锋受保护的技术使用者：西藏自治区农牧科学院蔬菜研究所技术研发日：技术公布日：2024/9/9