一种纯化重组人生长激素的方法与流程

本发明属于蛋白纯化，尤指一种纯化重组人生长激素的方法。

背景技术：

1、人生长激素(human growth hormone，hcg)是脑垂体前叶嗜酸性粒细胞分泌，191个氨基酸组成分子量约为22kda的肽类激素，在人体内发挥广泛生理功能。hcg的链内存在四个cys，能够形成两对二硫键(c54-c165，c182-c189)，无糖基化。生长激素能影响包括脑组织、造血系统及免疫组织几乎所有的组织类型和细胞，主要作用是刺激骨、软骨细胞的生长和分化，调节蛋白质、糖类及脂肪的代谢，具有一定的种属特异性。分泌型基因重组人生长激素的氨基酸含量和序列以及蛋白质结构与人垂体分泌的生长激素完全相同且具有同等的作用。在临床上，生长激素已经应用于治疗侏儒症、性早熟和重度烧伤等，目前还被用于美容领域来提供加速新陈代谢、修复受损组织、抗衰老等服务。

2、近些年来，重组生长激素在临床上的应用所取得效果引起广泛关注，有关分泌型基因重组人生长激素的基因设计、蛋白表达和纯化的研究层出不穷。大多数是将人生长激素(rhcg)表达基因导入到大肠杆菌中表达，经疏水、离子交换和分子筛等层析方式纯化出目的蛋白。专利cn114213525b采用大肠杆菌表达生长激素，发酵液经处理后微滤和超滤，使用疏水层析phenyl hp所得的生长激素纯度达到95.80％。除此之外，专利cn116589599a提出rhcg-fc融合蛋白的方法，通过亲和层析捕获蛋白、低ph病毒灭活、阴离子交换层析和阳离子疏水复合层析去除杂蛋白和宿主残留蛋白，最后纳滤和超滤获得符合质量要求的产物。专利cn113845585a公开报道利用大肠杆菌表达重组rhcg，并使用imac金属螯合亲和填料去除rhcg中内毒素的方法，但后续的纯化方式尚未提及。

3、对于rhcg，采用多种纯化方式往往仍具有纯度不合格、宿主细胞蛋白、宿主细胞dna和内毒素残留不达标等问题，现阶段亟需开发出采用更少纯化步骤，来满足更高质量标准的纯化方法。

技术实现思路

1、针对以上技术问题，本发明的目的在于提供一种纯化重组人生长激素的方法，具有纯化步骤少、操作简单、成本低且质量稳定的特点，可获收率大于20％，并达到质量要求：sds-page≥95％；宿主细胞蛋白(hcp)残留<10ppm；宿主细胞dna(hcd)残留<2.5ppm。

2、为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

3、一种纯化重组人生长激素的方法，包括：

4、将重组人生长激素酶切后的样品溶液依序经过phenyl bestarose ff(hs)、phenyl bestarose hp和q bestarose hp作为层析介质的纯化步骤。

5、上述方案中，phenyl bestarose ff(hs)为在6％的琼脂糖基架上高取代(highsub)偶联苯基疏水基团而成的，琼脂糖基架的高物理和化学稳定性，使其具有良好的压力流速性能，成为规模纯化工艺的理想选择，适合于重组蛋白、抗体、酶、核酸等疏水性不太强的生物分子的分离纯化，特别是在需要高流速分离过程的捕获或中度纯化阶段。

6、上述方案中，phenyl bestarose hp疏水介质的基架为高度交联的琼脂糖，保留了天然多糖化合物极好的亲水性及孔结构，对生物大分子具有很好的相容性，平均粒径为34μm，与phenyl bestarose ff相比具有较高的分辨效率，其表面含有疏水性配基(苯基)，特别适用于重组蛋白、抗体、疫苗、vlp颗粒等疏水性强弱一般的生物分子的中度及精细分离纯化。

7、上述方案中，q bestarose hp是一种强阴离子交换介质，基于刚性的、高度交联的球状琼脂糖颗粒上，平均粒径为34μm，具有良好的物理和化学稳定性，不同批次重复性好，用于蛋白质的分离和纯化。

8、作为优选方案，将phenyl bestarose ff(hs)作为层析介质的纯化步骤1，工艺条件包括：所述重组人生长激素的酶切后样品，用饱和硫酸铵调节电导和平衡缓冲液1一致，上样量为15～20mg/ml、接触时间为5～7min、上样蛋白浓度为≤7mg/ml；使用缓冲液组合1，所述缓冲液组合1包括平衡缓冲液1及洗脱缓冲液1，具体组成及参数控制为：

9、平衡缓冲液1：15～25mm pb+0.50～0.30m硫酸铵，ph7.0～7.5；

10、洗脱缓冲液1：15～25mm pb+0.20～0.10m硫酸铵，ph7.0～7.5。

11、作为优选方案，利用洗脱缓冲液1收集重组人生长激素的过程中，在紫外吸收值升高到150mau/mm时开始收集，低于40mau/mm时停止收集。

12、作为优选方案，将phenyl bestarose hp作为层析介质的纯化步骤2，工艺条件包括：将phenyl bestarose ff(hs)层析的洗脱液用饱和乙酸铵调节电导和平衡缓冲液2一致，上样量为10～20mg/ml、接触时间为5～7min；使用缓冲液组合2，所述缓冲液组合2包括平衡缓冲液2、清洗缓冲液及洗脱缓冲液2，具体组成及参数控制为：

13、平衡缓冲液2：15～25mm pb+0.6～1.0m乙酸铵，ph7.0～7.5；

14、清洗缓冲液：15～25mm pb+0.15～0.05m乙酸铵，ph7.0～7.5；

15、洗脱缓冲液2：15～40mm pb，ph7.0～7.5。

16、作为优选方案，利用洗脱缓冲液2收集重组人生长激素的过程中，在清洗缓冲液洗脱的紫外吸收值大于450mau/mm时更换洗脱缓冲液并开始收集至50mau/mm。

17、作为优选方案，将q bestarose hp作为层析介质的纯化步骤3，工艺条件包括：将phenyl bestarose hp层析的洗脱液用纯水调节电导和平衡缓冲液3一致，上样量为30～50mg/ml、接触时间为5～7min；使用缓冲液组合3，所述缓冲液组合3包括平衡缓冲液3和洗脱缓冲液3，具体组成及参数控制为：

18、平衡缓冲液3：15～25mm tris，ph7.0～7.5；

19、洗脱缓冲液3：15～25mm tris+0.10～0.20m氯化钠，ph7.0～7.5。

20、作为优选方案，利用洗脱缓冲液3收集重组人生长激素的过程中，从紫外吸收值为100mau/mm收集至100mau/mm。

21、作为优选方案，所述粗分离样品为重组人生长激素的发酵原液经ni离子亲和介质纯化并酶切his标签后的溶液。

22、作为优选方案，所述重组人生长激素的分子量为22kda、等电点为5.2、消光系数为1.3，酶切液的浓度为5～7mg/ml；蛋白在ph5.5-7.5之间保持稳定，能够耐受最高1m硫酸铵盐溶液。

23、作为优选方案，各纯化步骤中，保持样品、溶液和环境温度均为20～22℃。

24、本发明采用以上技术方案至少具有如下的有益效果：

25、1.本发明所筛选的以phenyl为配基的疏水作用介质中，phenyl bestarose ff(hs)和phenyl bestarose hp能够有效去除杂蛋白，特别是对于目标杂蛋白的去除(图1)。这两种介质需要采用切峰收集的方式来得到较纯的样品，前者采用硫酸铵盐溶液分离杂蛋白效果好，后者需要更换盐析效应较弱的乙酸铵盐溶液来分离杂蛋白。第三步层析所筛选的阴离子交换介质qbestarose hp浓缩样品体积，降低hcp、hcd，进一步去除杂蛋白。

26、2.本发明提供一种纯化重组人生长激素的方法，酶切液样品经phenyl bestaroseff(hs)、phenyl bestarose hp和q bestarose hp纯化的样品可获收率大于20％，并达到质量要求：sds-page≥95％；宿主细胞蛋白(hcp)残留<10ppm；宿主细胞dna(hcd)残留<2.5ppm。此方法具有纯化步骤少、操作简单、成本低且质量稳定的特点。