一种金属离子调控蚜虫莫氏黑粉菌合成胞外甘露糖赤藓糖醇脂的生产方法

一、：本发明涉及生物制品，具体涉及一种金属离子调控蚜虫莫氏黑粉菌合成胞外甘露糖赤藓糖醇脂的生产方法。

背景技术

0、二、背景技术：

1、甘露糖赤藓糖醇脂(mels)来自念珠菌属，是一种新型的胞外微生物表面活性剂，与化学表面活性剂相比，mels不仅具有比较确定的分子结构和优良的界面性能，还具有乳化性、抗菌性、高安全性、良好的生物降解性以及稳定性，在生物医药、化妆品和食品等领域中应用前景广泛。

2、mels主要由霉菌和酵母等在各种不同碳源中产生，它以甘露糖和糖醇赤藓糖醇作为亲水部分，以乙酰基和脂肪酸作为疏水部分，根据乙酰基的数量和位置，分为mel-a、mel-b、mel-c和mel-d四种构型。mel-a表示双乙酰化化合物，而mel-b和mel-c分别在c6和c4位单乙酰化，mel-d为完全脱乙酰化结构。研究表明，对于特定菌种，mels的产量和构型主要取决于培养基的组成和培养条件。已有相关文献报道，在mels发酵生产过程中，碳源、氮源、ph值、温度、溶氧及培养方式等都对糖脂的产量会产生影响，而金属离子对糖脂产量及构型影响的研究发现极少。

3、在工业化生产中，由于发酵装置的组成及发酵用水和发酵原料等因素，使得一些金属离子在发酵培养基中往往是超量的。然而金属离子对微生物的次生代谢合成具有调节作用，并可作为营养物质，某些金属离子以辅基或辅酶的形式参与微生物体内某些酶系的合成，与底物竞争酶的分子的活性位点，进而影响蛋白酶活，对微生物体的代谢起着重要的调节作用。有研究表明，k+、na+通过产生不同的渗透压影响微生物生长；ni+对某些表面活性剂产量有显著的促进作用；在培养基中添加适量的fe2+，有利于菌体的生长；cu2+、mg2+、mn2+、zn2+是次生代谢合成关键酶的辅因子，在细胞水平和分子水平对真菌生长及真菌毒素的合成具有调节效应，影响产物产量；ca2+参与蛋白酶的合成；ba2+可能会抑制角蛋白酶的活性；sn2+可促进核酸及蛋白质的合成，能催化氧化还原反应；当金属离子协同作用时，al3+与cu2+有一定的拮抗作用；cr3+可诱导生物表面活性剂合成；fe3+是一种重要的酶激活剂，特别是异柠檬酸裂解酶。

4、关于糖脂合成研究中，研究发现低浓度fe2+和zn2+有助于槐糖脂的合成，而高浓度起到抑制作用。mg2+、cu2+、fe2+对于槐糖脂的合成以及内酯型、酸型的组成比例具有调控作用。mn2+有助于促进ceriporia lacerate发酵生产mels。fe2+或fe3+抑制蚜虫莫氏黑粉菌mels合成，引起mels产量降低；而ca2+、mg2+极大地促进mels合成。mg2+可以调控mels产物的组分构成，缺乏mg2+时发酵产物的mels中仅含有mel-a。然而未能实现高效率合成mel-a。

技术实现思路

0、三、技术实现要素：

1、本发明要解决的技术问题是：为了克服现有生产过程中制约甘露糖赤藓醇脂生产的产量较低，应用所需要的不同构型分离纯化困难、成本较高等问题，本发明提供一种基于金属离子调控产生甘露糖赤藓醇脂合成产量提高或直接合成单一构型的方法，即本发明提供一种金属离子调控蚜虫莫氏黑粉菌合成胞外甘露糖赤藓糖醇脂的生产方法。通过本发明技术方案，可简化生产和分离纯化过程中的繁琐步骤和成本，提高应用水平。

2、为了解决上述问题，本发明采取的技术方案是：

3、本发明提供一种金属离子调控蚜虫莫氏黑粉菌合成胞外甘露糖赤藓糖醇脂的生产方法，所述生产方法包括以下步骤：

4、a、首先将蚜虫莫氏黑粉菌(moesziomyces aphidis)dsm 70725置于活化培养基中进行培养，培养温度为25～30℃、培养时间为36～48h；

5、所述培养基的组成为：酵母浸粉3.0g、麦芽提取物3.0g、葡萄糖10.0g、大豆蛋白胨5.0g和去离子水1.0l；

6、b、将步骤a活化培养后的蚜虫莫氏黑粉菌接入种子培养基中进行培养，培养温度为25～30℃、培养时间为48～60h；

7、所述种子培养基的组成为：nano3 3.0g、mgso4·7h2o 0.3g、kh2po4 0.3g、酵母浸粉1.0g、葡萄糖40.0g和去离子水1.0l；

8、c、将步骤b培养后的蚜虫莫氏黑粉菌接种发酵培养基中进行培养发酵，发酵温度为27～30℃、发酵时间为7～10d；

9、所述发酵培养基的组成为：nano3 3.0g、kh2po4 0.3g、酵母浸粉1.0g、大豆油80.0ml、去离子水1.0l和金属离子；

10、d、利用乙酸乙酯将步骤c发酵后所得发酵液中的产物进行萃取分离或纯化，旋蒸后得到混合构型或单一a型甘露糖赤藓糖醇脂产品。

11、根据上述的金属离子调控蚜虫莫氏黑粉菌合成胞外甘露糖赤藓糖醇脂的生产方法，步骤b中所述活化培养后的蚜虫莫氏黑粉菌占种子培养基体积的1～3％。

12、根据上述的金属离子调控蚜虫莫氏黑粉菌合成胞外甘露糖赤藓糖醇脂的生产方法，步骤c中所述培养后的蚜虫莫氏黑粉菌占按发酵培养基体积的2～5％。

13、根据上述的金属离子调控蚜虫莫氏黑粉菌合成胞外甘露糖赤藓糖醇脂的生产方法，当调控甘露糖赤藓糖醇脂产量提升时，步骤c中所述金属离子及其浓度为0.360mmol/l的mg2+、0.270mmol/l的ca2+、0.005mmol/l的zn2+、0.005mmol/l的ba2+、0.135mmol/l的ba2+、0.010mmol/l的cr3+或0.135mmol/l的mn2+。

14、根据上述的金属离子调控蚜虫莫氏黑粉菌合成胞外甘露糖赤藓糖醇脂的生产方法，当调控合成a型甘露糖赤藓糖醇脂时，步骤c中所述金属离子及其浓度为0.810mmol/l的k+、0.015mmol/l的ni2+、0.135mmol/l的ni2+、0.015mmol/l的fe2+、0.405mmol/l的fe2+、0.005mmol/l的cu2+、0.135mmol/l的cu2+、0.135mmol/l的sn2+、0.810mmol/l的al3+、0.030mmol/l的fe3+、0.270mmol/l的fe3+或0.270mmol/l的cr3+。

15、根据上述的金属离子调控蚜虫莫氏黑粉菌合成胞外甘露糖赤藓糖醇脂的生产方法，当调控a型甘露糖赤藓糖醇脂高效合成时，步骤c中所述金属离子及其浓度为0.810mmol/l的al3+与0.135mmol/l的mn2+、0.810mmol/l的k+与0.135mmol/l的ba2+、0.135mmol/l的cu2+与0.010mmol/l的cr3+、0.015mmol/l的ni2+与0.010mmol/l的cr3+、0.135mmol/l的cu2+与0.270mmol/l的ca2+、0.030mmol/l的fe3+与0.005mmol/l的zn2+、0.135mmol/l的cu2+与0.005mmol/l的zn2+、0.405mmol/l的fe2+与0.270mmol/l的ca2+、0.270mmol/l的fe3+与0.005mmol/l的zn2+、0.405mmol/l的fe2+与0.005mmol/l的zn2+、0.135mmol/l的ni2+与0.270mmol/l的ca2+、0.135mmol/l的ni2+与0.010mmol/l的cr3+或0.135mmol/l的ni2+与0.005mmol/l的zn2+。

16、根据上述的金属离子调控蚜虫莫氏黑粉菌合成胞外甘露糖赤藓糖醇脂的生产方法，步骤d中所述乙酸乙酯与所得发酵液二者之间加入的体积比为1～3:1。

17、本发明技术方案中记载的金属离子浓度是指金属离子在发酵培养基中的浓度(油脂除外)。

18、本发明的积极有益效果：

19、1、现有mels发酵合成技术中，常通过对培养基中的碳源、氮源、碳氮比等有机营养素和发酵温度、溶氧量、ph等培养条件进行优化，实现mels的更高效合成，技术方法较容易实现、效率提升明显，但不同批次碳氮源等有机物品质的变化难以实现mels合成产量提升的稳定调控，不利于mels的工业规模化生产。本发明通过改变金属离子(即无机盐)的种类和浓度，从而有效实现mels合成产量的提升，调控所用物质简单、几乎不存在批次间产品差异，有助于保障mels合成产量提升的调控效果。

20、2、大量研究表明，a型mel(mel-a)具有良好的乳化性及多种生理学活性，在生物医药、食品等多个领域应用前景广泛。现有技术中，获得a型mels产品主要是利用柱层析色谱、制备液相色谱等色谱技术对混合构型的mels进行分离制备获得，所用试剂主要有氯仿、丙酮、甲醇等，具有毒性大、污染严重、成本高等问题，难以在工业生产中实现规模化生产。本发明通过添加1种或2种特定种类和浓度的金属离子(即无机盐)，从而实现发酵液中仅有a型mels的合成，后续仅需利用乙酸乙酯等低毒性溶剂萃取即可实现a型mels产品的制备，且所用有机溶剂可以回收重复利用，不仅具有调控方法简单、效果稳定、易控等优点，而且可以实现a型mels产品的低成本生产，具有工业化应用前景，为规模化生产奠定基础。