一种载体及其在提高罗汉果果实生产效率中的应用的制作方法

本发明涉及生物技术和植物基因工程，具体涉及一种载体及其在提高罗汉果果实生产效率中的应用。

背景技术：

0、技术背景

1、罗汉果(siraitia grosvenorii)，属于葫芦科多年生藤本植物，是一种广泛种植广西壮族自治区的植物。这种神奇的植物，自古以来就在中医药学中占有重要的地位，罗汉果果实也是天然的甜味剂罗汉果甜苷的重要来源。

2、在中医药学中，罗汉果被认为具有清热解毒、润肺止咳、利咽开音等功效。其果实晒干后，可以泡茶饮用，有助于缓解咽喉肿痛、声音嘶哑等症状。除了药用价值外，罗汉果在食品工业中也得到了广泛应用。由于其天然的甜味特性，罗汉果甜苷成为了许多低糖或无糖食品的理想甜味剂。随着健康饮食的日益普及，罗汉果作为一种天然、健康的甜味来源，越来越受到人们的青睐。未来，罗汉果的种植、加工和应用领域有望得到进一步拓展，为人们的健康生活提供更多可能性。

3、尽管罗汉果是一种具有重要经济价值和健康益处的植物，但其种植和管理需要大量的人力投入，包括整地、施肥、浇水、除草、搭架、病虫害防治和果实采摘等环节。同时，罗汉果对生长环境有较高的要求，需要适宜的气候条件和土壤环境才能正常生长和高产。由于上述难点，罗汉果的种植并未能在全国大范围推广，这导致罗汉果种质培育和驯化未被人们重点关注。而主茎和节间较长导致的营养生长过度是葫芦科作物未被驯化的特征，这导致葫芦科的作物(含罗汉果)在种植时需要较大的种植面积，耗时费力，肥效利用率低，生产效率低下。目前，随着人们对罗汉果的需求量的增大，罗汉果出现了供给不足，价格过高的市场行为，因此，提高罗汉果的生产效率具有巨大的市场价值。

4、此外，鉴于全球人口数量的迅猛增加以及可用于耕种的土地面积的逐渐减少，定向驯化改良农作物，以增强其生产效率，已经当之无愧地成为了农业发展的核心目标和首要任务。这不仅涉及到对传统农作物品种的改良，还包括采用现代化的农业技术，如精准农业、基因编辑等，来提升单位面积的产量，确保在有限的土地资源下，能够产出更多的粮食和其他农产品，满足人类社会日益增长的需求。

5、综上所述，为了满足市场对罗汉果甜苷的大量需求，同时又降低罗汉果的生产和管理成本，本领域迫切需要开发一种提高罗汉果生产效率方法。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明目的是提供提高罗汉果果实生产效率的发明方法，以至少在一定程度上缓解甚至解决上述背景技术中提出的问题中的至少之一。

2、第一方面，本发明提供一种载体，所述载体包含编码dreb1c、ugt720和cds功能性蛋白的核苷酸序列。

3、在一些实施方式中，所述dreb1c、ugt720和cds功能性蛋白各自独立地来源于植物、动物、微生物或其组合，优选来源于植物，可选自菊科、葫芦科、蔷薇科、十字花科、石竹科、豆科、葡萄科、禾本科、茄科、桑科或其组合，更优选选自拟南芥、水稻、罗汉果、丝瓜、南瓜、黄瓜、西葫芦、西瓜、苦瓜、冬瓜或其组合。

4、在一些实施方式中，所述dreb1c、ugt720和cds功能性蛋白的氨基酸序列依次如seq id no:1-3所示。可选地，编码所述dreb1c功能性蛋白的核苷酸序列为采用引物对seqid no:4-5从水稻cdna中扩增得到；编码所述ugt720功能性蛋白的核苷酸序列为采用引物对seq id no:6-7从罗汉果cdna中扩增得到；编码所述cds功能性蛋白的核苷酸序列为采用引物对seq id no:8-9从罗汉果cdna中扩增得到。

5、优选地，编码所述dreb1c、ugt720和cds功能性蛋白的核苷酸序列依次如

6、seq id no:10-12所示。

7、进一步地，所述载体中，所述编码所述dreb1c功能性蛋白的核苷酸序列、编码所述ugt720功能性蛋白的核苷酸序列和编码所述cds功能性蛋白的核苷酸序列的数量各自独立地为1-99个。

8、在一些实施方式中，所述载体为表达载体或克隆载体。可选地，所述载体为克隆载体，所述克隆载体为t载体或质粒载体，编码所述dreb1c、ugt720和cds功能性蛋白的核苷酸序列位于所述克隆载体上。

9、在一些实施方式中，所述载体为表达载体，所述表达载体包括含有所述核苷酸的表达盒，所述表达盒中还包含与所述核苷酸可操作地连接的控制表达元件；所述控制表达元件包括5’utr、3’utr、启动子、增强子、转录终止区和多腺苷酸化区中的至少之一。可选地，所述控制表达元件包括启动子；所述启动子选自诱导型启动子、组成型启动子、和组织特异性启动子中的至少之一；其中，所述组织特异性启动子包括韧皮部特异性启动子。

10、在一些实施方式中，所述载体为双元表达载体，所述表达盒位于所述双元表达载体中，所述双元表达载体包括细菌的ri质粒、ti质粒、ri衍生质粒以及ti衍生质粒中的至少之一；

11、其中，所述细菌包括农杆菌。

12、在一些实施方式中，所述表达载体具有可选择标记和/或具有可筛选标记。可选地，可选择标记包括抗生素抗性标记以及除草剂抗性标记中的至少之一。

13、可选地，所述抗生素抗性标记赋予对抗生素的抗性，所述抗生素包括卡那霉素、潮霉素、壮观霉素、链霉素、四环素、g418、博来霉素、嘌呤霉素、甲氨蝶呤、青霉素和庆大霉素中的至少之一。

14、可选地，所述除草剂抗性标记赋予对除草剂的抗性，所述除草剂包括磷酸氨基丁酸、草甘膦、溴苯氧乙酸、磺酰脲类除草剂和草铵膦中的至少之一。

15、可选地，所述可筛选标记包括荧光蛋白基因、β-葡萄糖苷酸酶基因、荧光素酶基因、木糖异构酶基因、磷酸甘露糖异构酶基因、淀粉酶基因、β-内酰胺酶基因中的至少之一。

16、第二方面，本发明提供上述的载体在改变罗汉果植株性状和/或提高罗汉果果实产量中的应用，其中，所述改变罗汉果植株性状包括缩短茎节长度和/或缩短主茎长度，所述提高罗汉果果实产量包括提高种植密度和/或提高单株产量。

17、第三方面，本发明提供一种改变罗汉果果实生产效率的方法，增加罗汉果植株中的dreb1c、ugt720和cds功能性蛋白的表达量。

18、可选地，通过将上述表达载体转入罗汉果，使得罗汉果中的dreb1c、ugt720和cds功能性蛋白的表达量增加。

19、可选地，所述表达载体中的编码dreb1c、ugt720和cds功能性蛋白的核苷酸序列经过密码子优化。

20、进一步地，所述转入步骤如下：

21、通过转化处理将所述表达载体转入罗汉果植物组织，以产生带有转化所述表达载体的植物细胞的罗汉果植物组织；

22、对转化的罗汉果植物组织进行筛选和培育，得到转化罗汉果。

23、进一步地，转化罗汉果的罗汉果植株的罗汉果果实生产效率发生改变，包含罗汉果植株主茎变短、茎节变短、株型变紧凑、单位种植数量提高、单位面积的产量提高、肥效利用率提高中的至少之一。

24、可选地，所述转化处理包括基因枪法、原生质体转染法、电穿孔法、显微注射法、花粉管通道转入、农杆菌介导的转化法以及超声波介导法中的至少之一。

25、可选地，所述转化处理为所述转农杆菌介导的转化法，所述农杆菌包含表达载体。

26、第四方面，本发明提供一种罗汉果果实生产效率的检测方法，检测待检测样品基因组中的基因dreb1c、ugt720和cds的含量和/或检测待检测样品的基因dreb1c、ugt720和cds的表达情况；

27、若待检测样品基因组中存在基因dreb1c、ugt720和cds和/或待检测样品中的基因dreb1c、ugt720和cds的表达均高于野生株，则判断待检测样品具有罗汉果果实生产效率提高的性能。

28、可选地，通过对所述基因dreb1c、ugt720和cds设计的引物对或探针或芯片对所述待检测样品进行检测。

29、可选地，检测待检测样品基因组中的基因dreb1c、ugt720和cds所用的引物对依次如seq id no:13-14、seq id no:15-16和seq id no:17-18seq id no所示；

30、检测待检测样品的基因dreb1c、ugt720和cds表达所用的引物对依次如seq idno:13-14、seq id no:19-20和seq id no:21-22所示。

31、可选地，检测基因表达所用的内参基因sgactin的引物对如seq id no:23-24所示。

32、可选地，所述待检测样品包括适宜于有性繁殖、无性繁殖或可再生的细胞或组织培养的材料。

33、进一步地，所述待检测样品包括以下材料中的任一种：愈伤组织、种子、叶、根、茎、胚根、胚芽。

34、第五方面，本发明提供检测罗汉果果实生产效率的引物，包括检测待检测样品基因组中的基因dreb1c、ugt720和cds所用的引物对依次如seq id no:13-14、seq id no:15-16和seq id no:17-18所示；和/或

35、检测待检测样品的基因dreb1c、ugt720和cds表达所用的引物对依次如seq idno:13-14、seq id no:19-20和seq id no:21-22所示所示。

36、可选地，检测基因表达所用的内参基因sgactin的引物对如seq id no:23-24所示。

37、第六方面，本发明提供含有上述引物的检测试剂盒。

38、本发明至少具有以下有益效果：

39、1.本发明发现增强罗汉果植株中的dreb1c、ugt720和cds功能性蛋白的表达能有效提高罗汉果植物的罗汉果果实生产效率。

40、2.本发明提供了含有编码dreb1c、ugt720和cds功能性蛋白的核苷酸序列的载体，为改变罗汉果果实生产效率提供技术基础。

41、3.本发明提供的表达载体在罗汉果中稳定表达，通过改变罗汉果植株的主茎长度和茎节长度而提高其生产效率。

42、4.本发明提供的提高罗汉果植物生产效率的方法，可以经济地且高产量地生产罗汉果果实，从而低成本的生产罗汉果甜苷。

43、5.本发明提供的提高罗汉果植物生产效率的方法，能够获得高生产效率的罗汉果植株，对其进行产业化种植可极大提高罗汉果果实的产量，减少了技术、设备和种植条件上的投入，降低了生产成本。

44、6.本发明还提供了罗汉果生产效率的检测方法以及引物和试剂盒，为快速辨别罗汉果的性能提供便利。

45、上述概述仅仅是为了说明书的目的，并不意图以任何方式进行限制。除上述描述的示意性的方面、实施方式和特征之外，通过参考附图和以下的详细描述，本发明进一步的方面、实施方式和特征将会是容易明白的。