一种TLAMP法检测猪源性成分的引物组及方法

本发明涉及分子生物学检测，具体涉及一种tlamp法检测猪源性成分的引物组及方法。

背景技术：

1、

2、常用的肉类检测方法，如形态学检测、蛋白质组学和基因(核酸)检测等。形态学检测技术主要是靠显微镜将待检测的肉类倍数放大，以此观察肉类组织的形态来判断肉的种类，但这种方法能够检测的范围较窄，还不能对其进行定性分析，很依靠人的主观性；蛋白质鉴定包括酶联免疫分析、sds-page电泳、等电点聚焦技术等，这些方法主要依靠检测不同物种间蛋白质的差异来进行物种鉴别。但由于蛋白质稳定性差，遇高温、酸、碱、重金属等化学制剂易变性，所以不适宜做熟肉制品的鉴别分析，在使用上有比较大的局限性。相对于蛋白质，dna检测技术具有较强的稳定性、高特异性和高灵敏度，所以在食品安全检测领域较常用的方法是基于dna的分子鉴别技术，聚合酶链式反应(pcr)技术因其高灵敏度和特异性而广泛应用于食品检测领域，但其对实验条件和设备的要求较高，限制了其在现场快速检测中的应用。

3、为了克服这些限制，等温扩增技术如环介导等温扩增(lamp)和逆转录环介导等温扩增(rt-lamp)等发展迅速。这些技术能够在恒温条件下快速扩增目标dna序列，操作简便，检测时间短，非常适合于现场快速检测。然而，传统的lamp技术在某些情况下仍需要进一步缩短检测时间，提高检测的灵敏度和准确性。我们前期发明出一种基于turn-back环引物的超快环介导等温扩增方法(tlamp)，相对于常见的lamp方法，tlamp在没有增加设计难度的情况下，具有更好的扩增效率和检测稳定性。在此背景下，本研究参考了基于turn-back，并且为了进一步改进tlamp的反应速率，我们在原方法的技术中引入了耐热无机焦磷酸酶和缺刻酶，旨在进一步提高肉类源性检测的效率。在参考tlamp技术下并加以改进，通过创新的引物设计，实现了对猪源性成分的快速、灵敏和特异检测，为食品安全监管提供了一种新的技术手段。此外，本研究还详细介绍了针对猪源性成分的特异性引物设计，这些引物能够有效地识别和扩增猪dna中的特异序列，从而确保检测结果的准确性。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种tlamp法检测猪源性成分的引物组及方法，该引物组具有较高的灵敏度和特异性，可以通过本发明方法实现猪源性成分的检测，大大缩短了检测时间，适合于现场快速检测，并且该方法不依赖复杂设备，操作简单方便，经济可行，有较大的推广应用价值。

2、本发明解决上述技术问题的方案如下：提供一种tlamp法检测猪源性成分的引物组，包括一对内引物(fip和bip)、一对外引物(f3和b3)和一对turn-back环引物(tlf和tlb)；内引物的核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示，外引物的核苷酸序列如seqid no.3和seq id no.4所示，turn-back环引物的核苷酸序列如seq id no.5和seq idno.6所示。

3、本发明还提供了一种tlamp法检测猪源性成分的试剂盒，包括上述tlamp法检测猪源性成分的引物组。

4、进一步，还包括dntp、betaine、bst dna聚合酶、模板dna、无机焦磷酸酶、缺刻酶nt.cvipii和sybr green i。

5、本发明还提供了一种tlamp法检测猪源性成分的方法，包括以下步骤：

6、(1)提取待测样本的dna作为模板dna；

7、(2)配制pcr反应体系，包括tlamp法检测猪源性成分的引物组、dntp、betaine、bstdna聚合酶、模板dna、无机焦磷酸酶、缺刻酶nt.cvipii、sybr green i和水；

8、(3)利用实时荧光pcr仪进行反应，记录荧光信号，得到实时荧光曲线图并分析。

9、进一步，步骤(2)中，反应体系总体积为10ul。

10、进一步，步骤(2)中，反应体系终浓度为：内引物1.6um、外引物0.4um、turn-back环引物0.8um、dntp 0.8um、betaine 1m、bst dna聚合酶0.24u/ul、模板dna 0.6ng/ul、无机焦磷酸酶0.1u/ul和缺刻酶nt.cvipii 0.1u/ul。

11、进一步，步骤(3)中，在60℃条件下反应20min。

12、本发明tlamp法检测猪源性成分的引物组扩增的目的基因片段为5’-attcattgacctcccagccccctcaaacatctcatcatgatgaaac ttcggttccctcttaggcatctgcctaatcttgcaaatcctaacaggcctgttcttagcaatacattacacatcagacacaacaacagctttctcatcagttacacacatttgtcgagacgtaaattacggatgagttattcgctatctacatgcaaac-3’；

13、本发明引物设计和扩增原理图如图1所示。该引物组的设计方法为：内引物fip的5’端与f1c区域相同，3’端与f2c区域互补；内引物bip的5’端与b1区域相同，3’端与b2c区域互补；外引物f3与f3c区域互补；外引物b3与靶基因的b3c区域互补；turn-back环引物tlf的5’端与f1c相同，3’端与lfc区域互补；turn-back环引物tlb的5’端与b1c区域相同，3’端与lbc区域互补。并且，引物需要满足的tm值要求为：fip/bip＝50-60℃；f3/b3＝50-60℃；tlf/tlb＝50-60℃。在具有链置换活性的dna聚合酶作用下，相较于六引物lamp扩增反应，turn back环引物可以产生更多的茎环产物，加速链位移，并且turn back环引物还能作为新的内部引物产生新的的哑铃扩增子，产生出新的扩增模板和扩增产物，进而形成多个扩增循环并引发指数扩增。

14、进一步，本发明方法还在扩增体系中加入了无机焦磷酸酶和缺刻酶，如图2和图3所示，无机焦磷酸酶可以将dntp的结合时产生的焦磷酸(ppi)水解，防止ppi的积累造成的反应抑制，从而促进dna的合成；缺刻酶可以在dna延伸过程中，在双链中识别序列一侧发生剪切，dna合成酶可以从该缺刻位置重新产生扩增反应，并且剪切下来的dna单链又可以作为一个新的模板，使其开始进行dna扩增进一步提高扩增效率。

15、本发明具有以下有益效果：

16、1、本发明针对猪的目标基因，设计并筛选到了符合tlamp法检测要求且具有高灵敏度和高特异性的引物。

17、2、本发明引物组针对猪肉源基因的特异区域进行精确匹配，确保了检测结果的高度特异性，有效避免了非目标序列的干扰，提高了检测的准确性；该引物组通过新增的六种哑铃状结构和三个扩增循环，显著提高了扩增效率，实现了对猪肉源基因的超快速检测，与传统方法相比，大大缩短了检测时间，提高了工作效率。

18、3、本发明引物组具有较强的与靶基因的结合能力，提高了扩增反应的灵敏度，即使是低丰度的猪源基因也能被有效检测，确保了检测结果的可靠性。并且，其具有广泛的适用性，无论是在生肉类检测，还是加工肉制品检测都能够发挥重要作用，为猪肉源基因的检测提供了一种强有力的工具。

19、4、本发明方法在扩增体系中引入无机焦磷酸酶和缺刻酶，进一步加快了tlamp法的检测效率，实现了对猪肉源基因的超快速检测，与传统方法相比，大大缩短了检测时间，提高了工作效率。该方法无需复杂的温度循环设备和复杂的操作步骤，仅需简单的混合反应体系，即可在等温条件下快速完成扩增，极大地方便了实验操作，尤其适合于现场快速检测(poct)。并且，该方法中反应使用的试剂和酶来源广泛，易于获取，且成本较低，使得猪源基因检测变得更加经济可行，有助于推广应用，提高检测的普及率。