一种快速鉴定绵羊肺炎支原体的引物组及其应用

本发明涉及生物，更具体的说是涉及一种快速鉴定绵羊肺炎支原体的引物组及其应用。

背景技术：

1、近年来，绵羊肺炎支原体感染明显增加，对羊养殖业带来很大的挑战。传统的生物学鉴定方法主要依据细菌生长速度、对药物耐受性、生化反应、分子生物学鉴定等，方法复杂、费时，在得到分离培养物后仍需2～4周方能获得结果。尽管近年来绵羊肺炎支原体的检测技术取得了显著进展，不仅有基于pcr的多种核酸鉴定方法，还涌现出了各种等温扩增检测技术，但现有技术大多过于注重灵敏度和特异性的提升，而忽视了实际操作的简便性。这意味着目前的检测方法往往依赖于复杂的实验仪器和专业的操作人员，这在很大程度上限制了它们在实地应用中的快速准确检测。

2、因此，提供一种既操作简单又反应迅速、灵敏且特异性强的绵羊肺支原体肺炎检测方法，对于有效防控绵羊支原体肺炎，保障畜牧业的健康发展，具有不可估量的重要价值。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种快速鉴定绵羊肺炎支原体的引物组及其应用。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种快速鉴定绵羊肺炎支原体的引物组，所述引物组包括seq id no.1、seq idno.2和seq id no.3。

4、本发明的又一目的是，提供一种快速鉴定绵羊肺炎支原体的产品，所述产品包括上1述的引物组。

5、优选的，所述产品为试剂盒。

6、本发明的又一目的是，提供一种快速鉴定绵羊肺炎支原体的方法，包括以下步骤：

7、s1：提取待检样品的dna；

8、s2：利用上述的seq id no.1和seq id no.2对待测dna进行raa扩增；

9、扩增结束用dna抽提液与raa扩增产物混匀后12000rpm离心5min，取上层清亮液体备用；

10、s3：利用crispr/cas12a反应体系对s2所得上层清亮液体进行切割，crispr/cas12a体系中引物为上述seq id no.3；

11、s4：结果判定，将检测试纸条插入s3反应管中，样品垫端朝下，常温下放置5min判读结果，若试纸条c线显色，t线不显色，判为阴性；若c线显色，t线肉眼可见，判为阳性；若c线不显色，t线肉眼可见，判为阳性；若c线t线均不显色，判为无效。

12、优选的，s2所述raa扩增反应体系包括：上下游引物各1μl，a buffer 14.7μl，bbuffer 1.25μl，模板dna 2.5μl，用灭菌去离子水补齐到25μl；所述引物浓度为10μmol/l；

13、所述raa扩增反应条件39℃反应30min。

14、优选的，s3所述crispr/cas12a反应体系包括：1×holmes buffer 2μl；cas12nuclease 0.3μl；grna 0.6μl；target dna 4μl；ssdna 1μl，用灭菌去离子水补齐到20μl；所述grna、cas12nuclease、ssdna浓度为10μmol/l；

15、所述crispr/cas12a反应条件为37℃反应8min。

16、优选的，s4所述检测试纸条中有两个条带，靠下的质控线称为c线，包被有亲和素sa，靠上的检测线称为t线，包被有羊抗鼠二抗，胶体金上标记抗fitc/fam单抗。

17、重组酶介导等温扩增(raa)技术以其卓越的灵敏性和简便性，在疾病快速检测领域得到了广泛应用。然而，单一的raa检测方法仍存在一定的假阳性风险，这在一定程度上限制了其应用效果。本发明，将raa技术和crispr/cas切割反应结合联合应用于快速鉴定绵羊肺炎支原体，兼具raa技术的便捷性和crispr/cas系统检测技术的高准确性，开发出一种高效且实用的绵羊肺支原体检测方法。

18、利用本发明快速鉴定绵羊肺炎支原体的引物组进行绵羊支原体的检测，操作便捷，不需要昂贵的仪器设备，且不受检测场所限制。且在试纸条为结果的判读方法中，检测特异性好，检测灵敏度高，最低检出量为1.0×102copies/μl。本发明对于绵羊肺炎支原体感染的诊断具有较高的参考价值，适于推广应用。

技术特征：

1.一种快速鉴定绵羊肺炎支原体的引物组，其特征在于，所述引物组包括seq idno.1、seq id no.2和seq id no.3。

2.一种快速鉴定绵羊肺炎支原体的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1所述的引物组。

3.根据权利要求2所述的快速鉴定绵羊肺炎支原体的产品，其特征在于，所述产品为试剂盒。

4.一种快速鉴定绵羊肺炎支原体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述快速鉴定绵羊肺炎支原体的方法，其特征在于，s2所述raa扩增反应体系包括：上下游引物各1μl，abuffer14.7μl，b buffer 1.25μl，模板dna 2.5μl，用灭菌去离子水补齐到25μl；所述引物浓度为10μmol/l；

6.根据权利要求4所述快速鉴定绵羊肺炎支原体的方法，其特征在于，s3所述crispr/cas12a反应体系包括：1×holmes buffer2μl；cas12 nuclease 0.3μl；grna 0.6μl；targetdna 4μl；ssdna 1μl，用灭菌去离子水补齐到20μl；所述grna、cas12nuclease、ssdna浓度为10μmol/l；

7.根据权利要求4所述快速鉴定绵羊肺炎支原体的方法，其特征在于，s4所述检测试纸条中有两个条带，靠下的质控线称为c线，包被有亲和素sa，靠上的检测线称为t线，包被有羊抗鼠二抗，胶体金上标记抗fitc/fam单抗。

技术总结本发明公开了一种快速鉴定绵羊肺炎支原体的引物组及其应用，涉及生物技术领域，所述引物组包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。利用本发明快速鉴定绵羊肺炎支原体的引物组进行绵羊支原体的检测，操作便捷，不需要昂贵的仪器设备，且不受检测场所限制。且在试纸条为结果的判读方法中，检测特异性好，检测灵敏度高，最低检出量为1.0×10<supgt;2</supgt;copies/μL。本发明对于绵羊肺炎支原体感染的诊断具有较高的参考价值，适于推广应用。技术研发人员：周伟光,杨林,张志丹,希尼尼根,邹美娟,王旭芬,侯琳,张嘉磊,特木尔巴根受保护的技术使用者：内蒙古农业大学技术研发日：技术公布日：2024/9/29