一种基于适配体和血糖仪的信号循环放大马拉硫磷检测方法

本发明属于食品安全检测，具体涉及一种基于适配体和血糖仪的信号循环放大马拉硫磷检测方法。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、马拉硫磷是果蔬种植过程中常用的有机磷杀虫剂，也常作为谷物储藏的保护剂。马拉硫磷虽属于低毒性化合物，但长期不合理的使用会导致环境及食品中马拉硫磷残留量超标，经食物链的富集进入人体内，通过抑制乙酰胆碱酯酶的活性，造成肝脏以及中枢神经系统受损，严重的可导致中毒死亡。因此，研究快速、灵敏、可靠的有机磷农药检测方法迫在眉睫，开发农药残留的快速检测技术在食品安全、环境保护等方面具有重要意义。

3、适配体是通过体外筛选技术-指数富集配体系统进化技术(selex)，从随机单链寡聚核苷酸文库中得到的一种能特异结合待测靶标(如蛋白质或其他的小分子物质)的单链核苷酸，具有易合成、可修饰性强、结构简单、性质稳定等优势。其在检测分析领域中的应用已经被广为认可，在食品中被严格控制的诸多有害物质包括生物类毒素、重金属、抗生素等的核酸适配体在食品检测领域已经得到了初步的应用。例如专利cn104894137a公开了一种基于马拉硫磷核酸适体检测马拉硫磷的方法，将马拉硫磷核酸适体与标靶溶液孵育，接着加入分子信标再次孵育，最后检测体系的荧光强度，并与空白对照组比较，计算荧光抑制率，以实现马拉硫磷的检测分析。但是该方法对马拉硫磷的检测灵敏度较低，检出限高(5μmol/l)。田恒旗等人(田恒旗,王耀,杨海涛,等.马拉硫磷的纳米金适配体比色传感检测方法[j].食品科学,2023,44(18):324-330.doi:10.7506/spkx1002-6630-20220915-142.)基于纳米金在高盐溶液中会发生团聚而导致溶液颜色发生变化的原理，建立了一种新型的马拉硫磷鼻塞传感检测方法，在马拉硫磷质量浓度为50～1500ng/ml范围内呈现良好的线性关系，检出限为45.54ng/ml。但是该方法需要用uv-2600紫外可见分光光度计扫描350～750nm的紫外吸收光谱，检测成本高，难以实现现场的实时定量检测。因此，针对马拉硫磷，开发便携、简单快速、高灵敏、可以实现现场实时监测的定量检测方法尤为迫切。

技术实现思路

1、为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于适配体和血糖仪的信号循环放大马拉硫磷检测方法，本发明提出由靶标激发的聚合酶循环扩增技术，有效结合适配体识别靶标技术和聚合物酶的dna扩增与解链技术，实现靶标激发后自动循环扩增，实现对靶标的高灵敏、便携式定量检测。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

3、本发明的第一个方面，提供一种基于适配体和血糖仪的信号循环放大的马拉硫磷检测试剂盒，其包括复合探针、dna聚合酶、蔗糖酶-dna、磁珠-dna和血糖仪；

4、所述复合探针包括复合物1和复合物2，所述复合物1由马拉硫磷功能适配体和引物1组成，所述复合物2由长链dna、引物2和dna桥组成；

5、所述马拉硫磷功能适配体的核酸序列如seq id no:1所示，所述引物1的核酸序列如seq id no:2所示，所述引物2的核酸序列如seq id no:3所示，所述dna桥的核酸序列如seq id no:4所示；

6、所述长链dna为单链dna，其核酸序列与引物1、引物2和dna桥的核酸序列互补。

7、在本发明的一些实施例中，所述长链dna的核酸序列如seq id no:5所示。

8、在本发明的一些实施例中，所述dna聚合酶为klenow酶。

9、在本发明的一些实施例中，所述蔗糖酶-dna的制备方法包括：

10、将sh-dna与pb缓冲液、三-(2-羧乙基)膦盐酸盐(tris2-carboxyethylphosphine，tcep)混匀，孵育，孵育完毕后，离心，得到处理后的sh-dna溶液；

11、将sulfo-smcc和蔗糖酶溶于缓冲液中，混匀，孵育，孵育完毕后，离心，洗涤，得到活化的蔗糖酶；

12、将处理后的sh-dna溶液和活化的蔗糖酶混合，孵育，孵育完毕后，离心，洗涤，得到蔗糖酶-dna。

13、在本发明的一些实施例中，所述sh-dna的核酸序列如seq id no:6所示。

14、在本发明的一些实施例中，所述磁珠-dna的准备方法包括：

15、取链霉亲和素修饰的磁珠加入缓冲液进行稀释，磁分离后，用缓冲液清洗，并用缓冲液复溶；然后，加入bio-dna孵育，孵育完成后，用缓冲液清洗并用缓冲液复溶，得到磁珠-dna。

16、在本发明的一些实施例中，所述bio-dna的核酸序列如seq id no:7所示。

17、本发明的第二个方面，提供一种上述的基于适配体和血糖仪的信号循环放大的马拉硫磷检测试剂盒在检测马拉硫磷中的应用。

18、本发明的第三个方面，提供一种基于适配体和血糖仪的信号循环放大的马拉硫磷检测方法，采用上述的基于适配体和血糖仪的信号循环放大的马拉硫磷检测试剂盒进行，包括如下步骤：

19、将待测样品与功能适配体混合均匀，进行第一次孵育；孵育完成后加入引物1并混匀，进行第二次孵育；孵育完成后加入复合物2、dtnp、缓冲液、dna聚合酶、磁珠-dna，混合均匀后，得到第一溶液，进行第三次孵育；孵育完成后，磁分离，清洗，去除多余的dna链和马拉硫磷，收集沉淀；

20、用dna-蔗糖酶复溶所得沉淀，进行第四次孵育，孵育完成后磁分离，清洗，去除上清液，用蔗糖溶液复溶，进行第五次孵育，孵育完成后采用便携式血糖仪测定葡萄糖浓度，基于葡萄糖浓度值的变化对马拉硫磷进行定性或定量检测。

21、在本发明的一些实施例中，建立不同浓度梯度的马拉硫磷和葡萄糖浓度的标准曲线，基于所述标准曲线进行马拉硫磷浓度的定量检测。

22、dna扩增形成双链的过程是在dna聚合酶作用下，由引物的3’端引入能和模板互补配对的碱基，从而扩增形成双链dna的过程。其中聚合酶链式反应技术(pcr)则是结合此原理进行的扩增技术。但pcr不断扩增是依靠外界温度的升高和降低从而实现核酸链的解链、退火及延伸的过程，依赖于有快速变化温度能力的仪器。因此pcr过程离不开昂贵的pcr仪控制条件。此外dna聚合酶除了具有dna扩增功能，还存在dna解链功能，在常温下以单链dna为模板进行扩增，在扩增的同时将模板上的双链dna部位解开并链置换出模板上原始互补链。通过调研，目前尚未有利用dna聚合酶扩增和链置换功能建立相应的循环放大系统的研究。

23、本发明提出了一种由靶标激发的聚合酶循环扩增技术，有效结合适配体识别靶标技能和聚合酶的dna扩增与链置换技术，实现靶标激发后自动循环扩增。循环过程所用核酸链无需任何标记，无需大型仪器设备，常温下便能完成。同时结合便携式血糖仪建立对靶标的高灵敏、便携式定量检测方法。此循环扩增技术可通过简单的更换适配体和引物链实现多种靶标的检测，具有普适性应用。

24、本发明的有益效果为：

25、本发明利用马拉硫磷适配体设计了一种由靶标激发的恒温自动循环扩增技术，并结合便携式血糖仪作为信号读取设备实现了马拉硫磷的高灵敏、便携式、定量快速检测。新建方法对马拉硫磷的检出限为190ng·ml-1，线性范围为100～2000ng·ml-1，能满足大部分实际样品的检测需求。同时此方法具有良好的特异性，在多种有机农药的混合系统对马拉硫磷的检测不会产生干扰。

26、此外，本实施例的快速检测方法具有普适性，通过简单更换适配体链和配套未修饰核酸链，能够实现致病菌、基因等的检测，比如检测致病菌鼠伤寒沙门菌，此方法对鼠伤寒沙门菌的检出限为9cfu·ml-1，线性范围为101～107cfu·ml-1，具有良好的特异性，稳定性和重复性。再比如检测循环肿瘤dna(即鼠类肉瘤病毒癌基因(kras))，此方法对循环肿瘤dna kras基因的检出限为44.7fm，且能有效区分靶标基因和只有一个碱基突变的核酸分子，具有良好的特异性。证明本实施例的循环信号检测技术具有可实现不同靶标检测的普适性，为食源性危害物的现场高灵敏检测提供新的技术支持。