一种检测麻腮风水痘联合减毒活疫苗病毒滴度的方法与流程

发明涉及生物，尤其涉及实时定量pcr技术用于麻腮风水痘联合减毒活疫苗中麻疹、腮腺炎及水痘病毒的感染性滴度检测。

背景技术：

1、麻疹、腮腺炎、风疹和水痘均为儿童常见的病毒性传染病，传播范围广且容易爆发。目前我国已将麻腮风联合疫苗纳入免疫规划程序，且水痘减毒活疫苗的接种使用也在不断推广中。麻腮风水痘联合减毒活疫苗(live attenuated measles，mumps，rubella andvaricella combined vaccine，mmrv)的研制不仅可以简化免疫程序，也降低了接种成本及漏接种率。准确测定联合疫苗中病毒的感染性滴度对于评估疫苗质量，确保疫苗的免疫效果具有重要意义。

2、《中国药典》规定，联合疫苗的滴度检测需要使用特异性抗血清将除待测病毒外的其他病毒完全中和。在实际操作中，常面临中和血清的质量、供应、对目的病毒的干扰等问题。而且中和处理需要高质量的抗血清，并经过严格的验证。如果某种病毒对中和处理过程敏感，还会导致结果的不准确，或导致实际滴度高于测定结果，不但可能造成接种量过高的安全性风险，同时增加了生产成本和社会成本。因此，需要开发无需中和处理的检测方法，用于产品质量控制。

3、开发出准确、高效的无需中和处理的麻疹、腮腺炎及水痘病毒的滴度检测方法对本领域来说具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种检测麻腮风水痘联合减毒活疫苗病毒滴度的方法及其引物探针组合。

2、本发明的第一方面，提供了一种检测麻疹、腮腺炎和水痘病毒病原体的引物探针组合，所述引物探针组合分别特异性结合于以下病原体基因并用于扩增对应于所述各基因的特异性扩增产物：麻疹病毒、腮腺炎病毒和水痘病毒；所述引物探针组合包括选自下组的引物对和探针：

3、用于扩增麻疹病毒的第一引物对及其探针，所述第一引物对及其探针选自：

4、(a1)如seq id no：1所示的上游引物、如seq id no：2所示的下游引物和如seq idno：3所示的探针，

5、(a2)如seq id no：4所示的上游引物、如seq id no：5所示的下游引物和如seq idno：6所示的探针，

6、(a3)如seq id no：7所示的上游引物、如seq id no：8所示的下游引物和如seq idno：9所示的探针；

7、用于扩增腮腺炎病毒的第二引物对及其探针，所述第二引物对及其探针选自：

8、(b1)如seq id no：10所示的上游引物、如seq id no：11所示的下游引物和如seqid no：12所示的探针，

9、(b2)如seq id no：13所示的上游引物、如seq id no：14所示的下游引物和如seqid no：15所示的探针；和

10、用于扩增水痘病毒的第三引物对及其探针，所述第三引物对及其探针选自：

11、(c1)如seq id no：16所示的上游引物、如seq id no：17所示的下游引物和如seqid no：18所示的探针，

12、(c2)如seq id no：19所示的上游引物、如seq id no：20所示的下游引物和如seqid no：21所示的探针，

13、(c3)如seq id no：22所示的上游引物、如seq id no：23所示的下游引物和如seqid no：24所示的探针。

14、在另一优选例中，所述病原体基因选自病原体的rna核酸。

15、本发明的第二方面提供了一种检测麻疹、腮腺炎及水痘病毒滴度的方法，所述方法包括步骤：

16、(a)提供检测样品，所述检测样品包括：麻疹、腮腺炎及水痘病毒的核酸提取物；

17、(b)使用如本发明第一方面所述的引物探针组合对所述检测样品进行实时定量pcr扩增反应，以麻疹、腮腺炎及水痘病毒的病毒参考品作为标准品，从而计算所述检测样品中麻疹、腮腺炎及水痘病毒的相对滴度。

18、在另一优选例中，所述检测样品通过将病毒样品接种至细胞并纯化细胞感染后的核酸提取物得到。

19、在另一优选例中，所述细胞选自：二倍体细胞(mrc-5、2bs、wi-38)、兔肾细胞(rk-13)、猴肾细胞(vero)和鸡胚成纤维细胞(cpe)。

20、在另一优选例中，所述接种选自：直接接种、吸附接种。

21、在另一优选例中，所述核酸提取物为rna提取物。

22、在另一优选例中，所述病毒参考品选自：单病毒参考品、多病毒参考品。

23、在另一优选例中，所述多病毒参考品是一定比例的麻疹、腮腺炎、风疹及水痘病毒的混合物。

24、在另一优选例中，所述麻疹、腮腺炎及水痘病毒来自麻腮风水痘联合减毒活疫苗。

25、在另一优选例中，在麻疹、腮腺炎及水痘病毒接种至所述细胞后24h至60h进行检测。

26、在另一优选例中，将所述病毒样品进行稀释后接种至所述细胞；优选地，1.5-5倍的稀释梯度，更优选地，2-3倍的稀释梯度，更优选地，3倍稀释梯度。

27、在另一优选例中，每次检测选择3到4个稀释梯度进行接种。

28、在另一优选例中，采用量反应平行线法计算所述检测样品中麻疹、腮腺炎及水痘病毒的滴度。

29、在另一优选例中，所述计算通过采用量反应平行线法中的3.3、3.2、4.3或4.2法进行测定。

30、在另一优选例中，选择参考品4个稀释度，每个稀释度4个复孔，样品3个稀释度，每个稀释度4个复孔的设置模式进行检测。

31、在另一优选例中，所述检测方法具有与药典三部的病毒滴定方法基本一致的检测回收率。

32、在另一优选例中，所述基本一致指在相同检测条件下，所述检测方法的平均检测回收率与药典三部的病毒滴定方法的平均检测回收率的差值不超过15％，较佳地不超过10％，更佳地不超过5％。

33、在另一优选例中，接种所述检测样品的体积为10-100μl/孔，优选10-50μl/孔，更优选20-30μl/孔，更优选20μl/孔。

34、在另一优选例中，所述方法是非诊断非治疗的。

35、在另一优选例中，所述方法是体外的。

36、在另一优选例中，所述pcr扩增的体系包括：模版rna、正向引物、反向引物、探针、其它缓冲试剂。

37、在另一优选例中，所述pcr扩增的体系为：总体积20μl，其中，rt-qpcr缓冲试剂5μl，浓度均为10μmol/ml的各病毒的上下游引物各0.8μl，各病毒的探针各0.2μl，rna模板8μl；

38、在另一优选例中，所述pcr扩增的程序为：50℃5min；95℃预变性20s；95℃变性3s，60℃退火30s，40个循环。

39、本发明的第三方面提供了一种检测麻疹、腮腺炎和水痘病毒病原体的试剂盒，所述试剂盒中包括(i)容器，和(ii)位于所述容器中的如本发明第一方面所述的引物探针组合。

40、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。