一种针对端炔化合物的稳定同位素标记试剂及其合成与应用

本发明涉及一种针对端炔化合物的稳定同位素标记试剂及其合成方法与应用，属于分析。

背景技术：

1、高效液相色谱-串联质谱（hplc-ms/ms）由于其高选择性、高灵敏度和同时监测多种分析物的能力，正逐渐成为端炔化合物分析中最主要的技术。其中，采用选择反应监测模式（srm）或多反应监测模式（mrm）可以选择性的监测待测样品中特定分析物，有效提高检测的灵敏度。然而，由于许多端炔化合物不稳定，在正离子模式下的电离效率较差，且在实际样品中的丰度较低，这对hplc-ms/ms分析提出了重大挑战（j. nat. prod. 2022, 85,105–114;j. agric. food chem., 2023, 71, 14814-14824）。此外，在使用hplc-ms/ms进行分析时，实际样品中复杂基质的存在也是另一个棘手的问题，由于样品基质和共洗脱的杂质引起的基质效应，可能会导致定量结果出现明显偏差，进而影响测量结果的准确性（anal. chim. acta, 2016, 905, 106-114）。

2、为了解决这些问题，近年来，稳定同位素标记技术得到了广泛的关注。该方法利用轻型/重型稳定同位素标记试剂，进行特定的化学标记反应。将轻同位素标签（如h或12c）引入实际样品中的目标分析物，将重同位素标签（如d或13c）引入标准品作为内标，然后将轻/重标记的样品混合进行hplc-ms/ms分析，通过采用重型同位素标记物作为内标，可以有效的改善基质效应带来的影响。然而，目前已发展的化学标记试剂都存在一定的缺陷，如化学标记反应速率慢、标记反应产率低、反应条件苛刻、标记产物信号弱等，此外许多标记试剂的合成方法复杂，不易制备，很大程度上限制了其应用。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种针对端炔化合物的稳定同位素标记试剂，该标记试剂具有合成简单、反应条件温和、选择性强、标记反应产率高、标记产物信号强等特点，结合hplc-ms/ms技术，可实现对端炔化合物的准确、高灵敏检测。

2、一、针对端炔化合物的稳定同位素标记试剂及其合成

3、本发明提供的稳定同位素标记试剂以苯环作为同位素基团，咪唑盐作为质谱信号增强标签，叠氮基作为反应基团，其化学名称为 d0/ d5-1-苄基-3-(3-叠氮丙基)-咪唑溴盐，化学结构如下式所示：

4、，

5、其中：当r=h时，称为 d0-1-苄基-3-(3-叠氮丙基)-咪唑溴盐，简写为 d0-abi；当r=d时，称为 d5-1-苄基-3-(3-叠氮丙基)-咪唑溴盐，简写为 d5-abi。

6、本发明提供的针对端炔化合物的稳定同位素标记试剂的合成方法，包括以下步骤：

7、（1）第一步取代反应，中间体ⅰ（ d0/ d5-1-苄基咪唑）的合成

8、将 d0/ d5-溶解于四氢呋喃中，咪唑、氢氧化钠溶解于超纯水中，在惰性气体保护的情况下将所得水溶液逐滴加入四氢呋喃溶液中，加热反应。反应结束后，冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，粗产物用二氯甲烷：水（3:1，v/v）萃取三次，合并有机相并加入无水硫酸钠进行干燥，过滤，减压蒸馏除去溶剂。采用硅胶柱层析的方法进行纯化，得到中间体ⅰ（ d0/ d5-1-苄基咪唑）。

9、步骤（1）中， d0/ d5-溴化苄与咪唑的摩尔比为1:1~1:3（优选为1:2~1:3）， d0/ d5-溴化苄与氢氧化钠的摩尔比为1:1~1:2.5（优选为1:1.5~1:2.5），反应溶剂水和四氢呋喃的体积比为1:1~1:8（优选为1:5~1:8），反应加热温度为65~85℃（优选为70~80℃），反应时间为2~8 h（优选为4~8 h）。

10、（2）第二步成盐反应，中间体ⅱ（ d0/ d5-1-苄基-3-(3-溴丙基)-咪唑溴盐）的合成

11、将中间体ⅰ和1,3-二溴丙烷溶解于乙腈中，加热反应。反应结束后，冷却至室温，减压蒸馏出除去溶剂，经硅胶柱层析得到中间体ⅱ（ d0/ d5-1-苄基-3-(3-溴丙基)-咪唑溴盐）。

12、步骤（2）中，中间体ⅰ和1,3-二溴丙烷的摩尔比为1:1~1:20（优选为1:4~1:10），反应加热温度为80~100℃（优选为85~95℃），反应时间为4~12 h（优选为6~12 h）。

13、（3）第三步取代反应，目标产物 d0/ d5-1-苄基-3-(3-叠氮丙基)-咪唑溴盐的合成

14、将中间体ⅱ和叠氮化钠溶解到n,n-二甲基甲酰胺溶剂中，加热反应。反应结束后，冷却至室温，加适量水后用正丁醇进行萃取，水洗，饱和食盐水洗，将有机相合并，无水硫酸钠干燥，减压除溶剂后得到目标产物 d0/ d5-1-苄基-3-(3-叠氮丙基)-咪唑溴盐。

15、步骤（3）中，中间体ⅱ和叠氮化钠的摩尔比为1:1~1:6（优选为1:3~1:5），反应加热温度为40~65℃（优选为50~65℃），反应时间为4~24 h（优选为8~24 h）。

16、合成机理如下：

17、

18、第一步，利用 d0/ d5-溴化苄与咪唑间发生的亲核取代反应制备中间体ⅰ，在氢氧化钠作用下，咪唑上的氮原子作为亲核试剂进攻 d0/ d5-溴化苄分子中带有部分正电荷的中心碳原子，溴离子作为离去基团离去，得到中间体ⅰ（ d0/ d5-1-苄基咪唑）；第二步，中间体ⅰ可与卤代烷烃1,3-二溴丙烷发生成盐反应生成季铵盐，得到中间体ⅱ（ d0/ d5-1-苄基-3-(3-溴丙基)-咪唑溴盐）；第三步，叠氮化钠的氮原子作为亲核试剂进攻中间体ⅱ中的溴原子，从而取代溴原子，生成目标产物 d0/ d5-1-苄基-3-(3-叠氮丙基)-咪唑溴盐。

19、二、本发明提供的针对端炔化合物的稳定同位素标记试剂在食品分析、环境分析、生命分析、药物分析、天然产物分析中的应用，用于检测样品中端炔化合物的浓度，包括以下步骤：

20、（1）配制浓度为100 ng/ml的端炔标准品甲醇溶液；配制 d0-1-苄基-3-(3-叠氮丙基)-咪唑溴盐的甲醇溶液作为轻型标记试剂溶液，配制 d5-1-苄基-3-(3-叠氮丙基)-咪唑溴盐的甲醇溶液作为重型标记试剂溶液；配制抗坏血酸钠和五水硫酸铜的水溶液。

21、（2）依次加入600 μl的超纯水、100 μl的样品、100 μl的轻型标记试剂溶液、100 μl的抗坏血酸溶液、100 μl的硫酸铜溶液于1.5 ml的离心管中，水浴加热反应，得到反应液a；

22、（3）依次加入600 μl的超纯水、100 μl的端炔标准品溶液、100 μl的重型标记试剂溶液、100 μl的抗坏血酸溶液、100 μl的硫酸铜溶液于1.5 ml的离心管中，水浴加热反应，得到反应液b；

23、（4）将上述反应液a和反应液b按照体积比1:1进行混合，混合后的溶液采用hplc-ms/ms进行分析；轻型标记试剂反应后得到的轻型标记产物的峰面积为a1，样品中端炔化合物的浓度为c1；重型标记试剂反应后得到的重型标记产物的峰面积为a2，端炔化合物的浓度为c2，根据公式a1/a2 =c1/c2，计算可得到样品中端炔化合物的浓度。

24、步骤（1）中， d0/ d5-1-苄基-3-(3-叠氮丙基)-咪唑溴盐甲醇溶液的浓度为1.5~310×10-5mol/l（优选为250×10-5mol/l），抗坏血酸钠水溶液的浓度为0.5~10×10-3mol/l（优选为3×10-3mol/l），硫酸铜水溶液的浓度为4~70×10-6mol/l（优选为40×10-6mol/l）。

25、步骤（2）和步骤（3）中，水浴加热反应温度为20~70℃（优选为60℃），反应时间为1~90 min（优选为60 min）。

26、检测机理如下：

27、

28、利用抗坏血酸钠在溶液中原位还原硫酸铜产生一价铜离子，叠氮基团和端炔化合物在一价铜离子的催化下发生1,3-偶极环加成反应，得到1,4-二取代的1,2,3-三氮唑标记产物。通过一价铜催化的叠氮-炔基环加成（cuaac）反应，可以在标记产物中引入带正电荷的咪唑盐作为质谱信号增强标签，从而增强其在质谱检测中的离子化效率，提高检测灵敏度。同时，该反应引入同位素基团所得到的重型标记产物可作为内标，用于改善基质效应带来的影响，从而提高检测的准确性。

29、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

30、本发明所述的针对端炔化合物的稳定同位素标记试剂是以苯环作为同位素标记基团，以咪唑盐作为质谱信号增强基团，以叠氮基作为反应基团，利用抗坏血酸钠与硫酸铜产生的一价铜离子催化下，实现叠氮基与端炔化合物之间的cuaac反应，通过调节标记试剂浓度、抗坏血酸钠与硫酸铜的浓度、反应温度和反应时间，实现高选择性、高效地标记端炔化合物，而且该标记试剂具有合成简单、反应条件温和、标记反应产率高、标记产物信号强等特点，结合hplc-ms/ms技术，可实现对端炔化合物进行准确、高灵敏的检测。