一种线性化质粒保存液及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物工程，具体涉及一种线性化质粒保存液及其制备方法和应用。

背景技术：

1、由于线性化质粒模板的质量会影响ivt反应中dsrna含量和mrna的质量：模板质量纯度越高，ivt反应中形成的dsrna含量会显著下降。这种现象背后的详细机制还未清楚，可能是由于杂质dna也会形成某些rna，与目标mrna形成双链结构造成的。如果模板质量不佳，单纯靠后续精纯工艺，很难将mrna原液中的dsrna含量降至符合质量标准线以下。因此，相比优化精纯工艺，将关注点放在提升模板质量上面，从源头上抑制dsrna合成，ivt后续纯化的压力将大为减轻。

2、线性化质粒是将超螺旋质粒进行酶切、纯化和缓冲液置换获得。目前，通常利用纯化水或者te缓冲液作为置换和保存线性化质粒的保存溶液。但不同保存溶液会导致线性化质粒的纯度存在不同程度的下降，且随着保存时间的增加，线性化质粒的纯度会进一步下降。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种线性化质粒保存液及其制备方法和应用，利用该保存液保存线性化质粒，能够保证线性化质粒的稳定性，以避免线性化质粒纯度下降。

2、为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：

3、本发明第一方面提供一种线性化质粒保存液，其包括10～200mm的tris-hcl、10～20mm的精氨酸(arg)、以及无酶水。

4、根据一些具体实施方式，所述tris-hcl的浓度为10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm、55mm、60mm、65mm、70mm、75mm、80mm、85mm、90mm、95mm、100mm、105mm、110mm、115mm、120mm、125mm、130mm、135mm、140mm、145mm、150mm、155mm、160mm、170mm、175mm、180mm、185mm、190mm、195mm或200mm；例如，所述tris-hcl的浓度为20～100mm。

5、本申请中的tris-hcl并非限定为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(tris盐酸盐)这一化合物，在配制线性化质粒保存液时，tris-hcl可以是通过tris碱以及盐酸的混合形成，以可以是tris盐酸盐形成。

6、根据一些具体实施方式，所述精氨酸的浓度为10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm或20mm。

7、根据一些具体实施方式，所述线性化质粒保存液还包括10～250mm的阳离子，其中，阳离子包括但不限于钠离子。优选地，所述阳离子以氯化钠的形式投料获得。例如，所述阳离子的浓度为10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm、55mm、60mm、65mm、70mm、75mm、80mm、85mm、90mm、95mm、100mm、105mm、110mm、115mm、120mm、125mm、130mm、135mm、140mm、145mm、150mm、155mm、160mm、170mm、175mm、180mm、185mm、190mm、195mm、200mm、210mm、220mm、230mm、240mm或250mm。例如，所述阳离子的浓度为20～170mm。

8、根据一些具体实施方式，所述线性化质粒保存液还包括0.1～10mm的edta。例如，所述edta的浓度为0.1mm、0.5mm、1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、5mm、5.5mm、6mm、6.5mm、7mm、7.5mm、8mm、8.5mm、9mm、9.5mm、或10mm。

9、根据一些具体实施方式，所述线性化质粒保存液的ph为7.0～8.5，例如ph为7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4或8.5，保存液的ph可以通过盐酸或者氢氧化钠进行调节，可以根据不同线性化质粒的理化差异选择合适的ph调节点。

10、根据一些具体实施方式，所述线性化质粒保存液的电导率为2～20ms/cm，例如电导率为2ms/cm、2.5ms/cm、3ms/cm、3.5ms/cm、4ms/cm、4.5ms/cm、5ms/cm、5.5ms/cm、6ms/cm、6.5ms/cm、7ms/cm、7.5ms/cm、8ms/cm、8.5ms/cm、9ms/cm、9.5ms/cm、10ms/cm、10.5ms/cm、11ms/cm、11.5ms/cm、12ms/cm、12.5ms/cm、13ms/cm、13.5ms/cm、14ms/cm、14.5ms/cm、15ms/cm、15.5ms/cm、16ms/cm、16.5ms/cm、17ms/cm、17.5ms/cm、18ms/cm、18.5ms/cm、19ms/cm、19.5ms/cm或20ms/cm。

11、本申请通过控制线性化质粒保存液的ph为7.0～8.5，电导率为2～20ms/cm，确保线性化质粒的稳定，不影响后续ivt反应的效率。

12、本发明第二方面提供一种所述的线性化质粒保存液的制备方法，将tris或tris-hcl、以及精氨酸与无酶水混合，选择性地加入nacl和edta，然后利用盐酸或氢氧化钠调整所述线性化质粒保存液的ph至7.0～8.5。

13、本发明第三方面提供一种线性化质粒的保存方法，包括如下步骤：

14、(1)制备线性化质粒；

15、(2)将步骤(1)制备的线性化质粒进行缓冲液置换，其中，所述缓冲液为权利要求1至5中任一项所述的线性化质粒保存液。

16、根据一些具体实施方式，步骤(2)置换完成后，控制所述线性化质粒的浓度为0.5～2mg/ml。

17、根据一些具体实施方式，步骤(1)的具体方法为：将三步层析或者两步层析制备的超螺旋质粒经过酶切线性化制得所述线性化质粒。

18、本发明第四方面提供一种mrna的制备方法，包括如下步骤：

19、(1)制备线性化质粒；

20、(2)将步骤(1)制备的线性化质粒进行缓冲液置换并保存，其中，所述缓冲液为权利要求1至5中任一项所述的线性化质粒保存液；

21、(3)将步骤(2)保存的含线性化质粒的缓冲液直接用于ivt反应，制备所述mrna。

22、由于采用上述技术方案，本发明与现有技术相比具有如下优点：

23、本申请通过添加精氨酸，以防止线性化质粒dna变性，添加tris-hcl维持保存液的ph稳定，进而确保线性化质粒的稳定性，避免线性化质粒在保存的过程中出现纯度的下降，进而确保线性化质粒不会对后续使用造成影响。本申请保存液保存的线性化质粒可以用于线性化质粒的实验室制备以及规模化生产。

技术特征：

1.一种线性化质粒保存液，其特征在于：其包括10～200mm的tris-hcl、10～20mm的精氨酸、以及无酶水。

2.根据权利要求1所述的线性化质粒保存液，其特征在于：所述线性化质粒保存液还包括10～250mm的阳离子。

3.根据权利要求1所述的线性化质粒保存液，其特征在于：所述线性化质粒保存液还包括0.1～10mm的edta。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的线性化质粒保存液，其特征在于：所述线性化质粒保存液的ph为7.0～8.5。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的线性化质粒保存液，其特征在于：所述线性化质粒保存液的电导率为2～20ms/cm。

6.一种如权利要求1至5中任一项所述的线性化质粒保存液的制备方法，其特征在于：将tris或tris-hcl、以及精氨酸与无酶水混合，选择性地加入nacl和/或edta，然后利用盐酸或氢氧化钠调整所述线性化质粒保存液的ph至7.0～8.5。

7.一种线性化质粒的保存方法，其特征在于：包括如下步骤：

8.根据权利要求7所述的线性化质粒的保存方法，其特征在于：步骤(2)置换完成后，控制所述线性化质粒的浓度为0.5～2mg/ml。

9.根据权利要求7所述的线性化质粒的保存方法，其特征在于：步骤(1)的具体方法为：将三步层析或者两步层析制备的超螺旋质粒经过酶切线性化制得所述线性化质粒。

10.一种mrna的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

技术总结本发明涉及一种线性化质粒保存液及其制备方法和应用，该线性化质粒保存液包括10～200mM的Tris‑HCl、10～20mM的精氨酸、以及无酶水。本申请通过添加精氨酸，以防止线性化质粒DNA变性，添加Tris‑HCl维持保存液的pH稳定，进而确保线性化质粒的稳定性，避免线性化质粒在保存的过程中出现纯度的下降，进而确保线性化质粒不会对后续使用造成影响。技术研发人员：杨薇,左静,肖瑶,朴希俊,任科云,王潇,梁华,熊淑婷,程金花,柯尊阳,李晨受保护的技术使用者：武汉楷拓生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/9/29