一种蟾酥药材中吲哚类生物碱单体化合物的分离纯化方法

本发明涉及生物医药，尤其涉及一种蟾酥药材中吲哚类生物碱单体化合物的分离纯化方法。

背景技术：

1、2020年版中国药典收载蟾蜍科动物中华大蟾蜍bufo bufo gargarizans cantor或黑眶蟾蜍bufo melanostictus schneider的耳后腺及皮肤腺分泌的白色浆液经加工干燥后制得的药材，是我国的传统中药，被广泛的应用于东南亚国家。传统中医将其用于治疗小儿疳疾、脑疳、背部疔疮及肿毒。据中国药典记载，蟾酥辛，温；有毒。归心经，具有解毒，止痛，开窍醒神功能，有毒。用于痈疽疔疮，咽喉肿痛，中暑神昏，痧胀腹痛吐泻，是传统中医及现代医学一种重要的动物源中药材，其药源动物主要有黑眶蟾蜍和中华蟾蜍两种。蟾酥化学成分复杂，蟾酥的药理活性强，现代药理和临床应用表明它具有强心、升压、利尿、镇痛及抗肿瘤等多种药理活性。也充分显示蟾酥对肝癌、肺癌、胃癌、肠癌等多种恶性肿瘤均有非常好的疗效。蟾酥中抗肿瘤活性成分主要为蟾毒配基类和吲哚生物碱类，其中蟾毒配基类主要包含华蟾酥毒基、脂蟾毒配基等成分，关于其化学性质和药理作用已进行了很多研究。

2、吲哚类生物碱属于蟾酥的水溶性成分，其开发形成的制剂华蟾素注射液临床上用于消化道中晚期癌症，疗效确切，体外抗肿瘤活性筛选也表明蟾酥水提取物对结肠癌细胞、肺癌细胞的生长均有明显的抑制作用。目前对于蟾酥中吲哚生物碱成分，中国药典中仅通过对二甲氨基苯甲醛显色法进行鉴别，现有技术未收载同时分离纯化吲哚生物碱化学成分的相关条件以及方法，因此，需要建立蟾酥中吲哚生物碱成分的分离纯化方法，以弥补蟾酥中吲哚生物碱单体化合物的分离纯化方面的空白，实现全面、有效的控制蟾酥的质量目的。

技术实现思路

1、针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种蟾酥药材中吲哚类生物碱单体化合物的分离纯化方法，通过超声提取、萃取除杂、高效制备液相色谱分离、结晶及干燥等步骤分离出高纯度的化合物单体，该分离方法简便可行、工艺可控、提高了对蟾酥药材的利用价值。

2、为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：一种蟾酥药材中吲哚类生物碱单体化合物的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

3、s1、超声提取

4、将蟾酥药材粉碎过筛，低碳醇溶液超声提取多次，真空浓缩至无醇度；

5、s2、萃取除杂

6、使用萃取试剂除去脂溶性杂质，在真空环境中使用浓缩液浓缩至小体积；

7、s3、高效制备液相色谱分离

8、将上述浓缩溶液澄清过滤后得到待制备溶液，利用液相色谱洗脱分离，按照不同成分的保留时间收集、合并洗脱液；再次进样后，收集高纯度馏分，并按照各成分保留时间合并相同组份；

9、s4、浓缩结晶

10、将收集的馏分在真空环境中浓缩结晶，过滤得到不同组分的结晶体；

11、s5、干燥

12、将不同组分的结晶体真空干燥，得到5-羟色胺、n-甲基-5-羟色胺、蟾蜍色胺、蟾蜍特尼定、去氢蟾蜍色胺、蟾蜍噻咛六个吲哚类生物碱单体化合物。

13、进一步的，在步骤s1、s2、s4中真空浓缩条件为：-0.05～-0.1mpa；40-80℃；步骤s2中浓缩液ph为1～4；步骤s4的结晶调节为：0～3℃温度下放置于1～24h。

14、进一步的，步骤s3中洗脱条件为10-40％比例的甲醇-酸-水梯度洗脱，酸浓度为0.1-2％。

15、进一步的，步骤s5干燥条件为在-0.05～-0.1mpa真空、60～80℃温度干燥。

16、进一步的，步骤s1中低碳醇为甲醇、乙醇、异丙醇中的一种。

17、进一步的，步骤s2中调节ph值所用酸为甲酸、乙酸、三氟乙酸、盐酸、硫酸中的一种；所用萃取试剂为乙醚、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯中的一种。

18、进一步的，步骤s3中制备液相色谱所用酸为甲酸、乙酸、磷酸、三氟乙酸中的一种；洗脱梯度为甲醇-水-乙酸体系、甲醇-水-磷酸体系、或甲醇-水-三氟乙酸体系。

19、进一步的，该分离纯化方法还包括分析型hplc纯度检测，分析条件为：

20、填料：c18(4.6*250mm，i.d.5um)，流速：0.8-1.2ml/min；

21、洗脱程序：0-20min、10-40％甲醇-酸水，检测波长：275nm；

22、进样量10ul，柱温25-40℃。

23、本发明的有益效果是：该蟾酥中吲哚生物碱的分离纯化方法，通过制备液相色谱等步骤一次性同时得到6中高纯度生物碱化合物单体，此种分离纯化方法相对于其他分离方法工艺简单、操作方便，能同时分离化合物单体的数量多、纯度好、均大于98％，可用作蟾酥化学成分研究用对照品以及药效活性筛选用的单体成分，对药品等的研究开发有很好的促进作用，并提高了对蟾酥的利用价值。

技术特征：

1.一种蟾酥药材中吲哚类生物碱单体化合物的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于：在步骤s1、s2、s4中真空浓缩条件为：-0.05～-0.1mpa；40-80℃；步骤s2中浓缩液ph为1～4；步骤s4的结晶调节为：0～3℃温度下放置于1～24h。

3.根据权利要求2所述的分离纯化方法，其特征在于：步骤s3中洗脱条件为10-40％比例的甲醇-酸-水梯度洗脱，酸浓度为0.1-2％。

4.根据权利要求3所述的分离纯化方法，其特征在于：步骤s5干燥条件为在-0.05～-0.1mpa真空、60～80℃温度干燥。

5.根据权利要求4所述的分离纯化方法，其特征在于：步骤s1中低碳醇为甲醇、乙醇、异丙醇中的一种。

6.根据权利要求5所述的分离纯化方法，其特征在于：步骤s2中调节ph值所用酸为甲酸、乙酸、三氟乙酸、盐酸、硫酸中的一种；所用萃取试剂为乙醚、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯中的一种。

7.根据权利要求6所述的分离纯化方法，其特征在于：步骤s3中制备液相色谱所用酸为甲酸、乙酸、磷酸、三氟乙酸中的一种；洗脱梯度为甲醇-水-乙酸体系、甲醇-水-磷酸体系、或甲醇-水-三氟乙酸体系。

8.根据权利要求7所述的分离纯化方法，其特征在于，还包括分析型hplc纯度检测，分析条件为：

技术总结本发明公开了一种蟾酥药材中吲哚类生物碱单体化合物的分离纯化方法，包括将蟾酥药材粉碎，以一定比例的含醇水溶液提取，减压浓缩，调节PH值，萃取除去酯溶性物质，水液减压浓缩至小体积，高效制备液相色谱分离以及紫外检测器跟踪监测等步骤，按照不同的保留时间分段收集，同时将蟾酥药材中6中生物碱单体化合物进行分离，纯度分别达到98.0％以上。本发明方法简便、可行、稳定性好、工艺可控，能有效的对蟾酥药材中的吲哚类生物碱进行分离纯化，提高了对蟾酥药材的利用价值，并为蟾酥药材的临床用药提供参考。技术研发人员：肖健,林利彬,王晓玲,胡嘉瑶,唐少旗受保护的技术使用者：宝鸡文理学院技术研发日：技术公布日：2024/9/29