一种食管癌小鼠模型的构建方法及应用

本发明属于基因工程，具体涉及一种食管癌小鼠模型的构建方法及应用。

背景技术：

1、肿瘤的发生是一个涉及到多基因变异、多通道调节、多因素相互作用的复杂生物学过程，食管癌的发生也是如此。将遗传变异与环境因素结合起来的复合造模成为当今应用广泛、效果最好的建立小鼠食管癌模型的方法。食管癌最常见的食管癌组织学亚型，一种是鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma，scc)，另一种是腺癌(adenocarcinoma)。目前关于食管癌研究所用的小鼠模型主要建立方法包括：(1)利用化学致癌剂4nqo或nmba诱导小鼠建立原发性小鼠食管癌模型，得到食管癌原位肿瘤组织。该模型优点是模拟了肿瘤患者暴露的长期诱导因素；缺点是肿瘤的形成时间和效率不确定，肿瘤表型有异质性。(2)将食管癌原位肿瘤组织移植至裸鼠皮下并进行体内培养，得到移植肿瘤组织。该模型优点是接近患者情况，能反映患者的个体疾病特征；缺点是该模型需要使用临床患者的肿瘤样本，取样要求高、难度大，同时使用的重度免疫缺陷小鼠饲养难度大，无法模拟免疫微环境。(3)建立小鼠食管类器官培养以及肿瘤模型，该模型优点是可在体外表现出与体内相似的细胞组成及生理功能；缺点是不能模拟肿瘤的发生发展过程中的变化。上述方法一定程度上为研究食管癌发生发展以及探索各种治疗手段提供了技术平台。

2、近年来，随着crispr/cas9技术的普及，基因编辑的方法及效率大大提高，利用基因编辑手段得到肿瘤模型小鼠是一个新的方式，而基因的全身编辑可能会影响小鼠的正常生长及生育能力。因此，构建一种小鼠的食管上皮组织的特异性癌变模型是十分重要的。

3、trp53基因为人体一种肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene)。该基因编码一种分子量为43.7kda的蛋白质，但因蛋白条带出现在marker所示53kda处，命名为trp53。因为蛋白中含有大量的脯氨酸，电泳速度被拖慢。trp53基因的失活对肿瘤形成起重要作用。trp53是一个重要的抗癌基因，其野生型使癌细胞凋亡，从而防止癌变；还具有帮助细胞基因修复缺陷的功能。trp53的突变型会提高癌变。在所有恶性肿瘤中，50％以上会出现该基因的突变。由该基因编码的蛋白质是一种转录因子(transcriptional factor)，其控制着细胞周期的启动。许多有关细胞健康的信号向trp53蛋白发送。关于是否开始细胞分裂就由这个蛋白决定。如果这个细胞受损，又不能得到修复，则trp53蛋白将参与启动过程，使这个细胞在细胞凋亡(apoptosis)中死去。有trp53缺陷的细胞没有这种控制，甚至在不利条件下继续分裂。像所有其它肿瘤抑制因子一样，trp53基因在正常情况下对细胞分裂起着减慢或监视的作用。trp53基因会判断dna变异的程度，如果变异较小，这种基因就促使细胞自我修复，若dna变异较大，trp53基因就诱导细胞凋亡。trp53基因突变后，由于其空间构象发生改变，失去了对细胞生长、凋亡和dna修复的调控作用，trp53基因由抑癌基因转变为癌基因。

4、ccnd1，即g1/s-特异性周期蛋白-d1，是一个由人类ccnd1基因所编码的蛋白质。ccnd1的基因属于高度保守的细胞周期家族。该家族在整个细胞周期中蛋白丰度具有周期性变化。ccnd1的主要功能是促进细胞增殖，其被公认为是一种原癌基因，过度表达可致细胞增殖失控而恶性化。研究表明，在多种肿瘤中发现了ccnd1基因过表达和基因扩增，包括乳腺癌、膀胱癌、甲状旁腺肿瘤、淋巴瘤、黑色素瘤/肺癌及细胞中心型淋巴瘤等。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种食管癌小鼠模型的构建方法。

2、本发明的另一目的在于提供上述构建方法的应用。

3、本发明的目的通过下述技术方案实现：

4、一种食管癌小鼠模型的构建方法，包含如下步骤：

5、(1)将ccnd1cki/cki纯合子小鼠与edl2-creki/ki纯合子小鼠杂交配繁，得到ccnd1cki/+；edl2-creki/+杂合子小鼠；将trp53fl/fl纯合子小鼠与ccnd1cki/cki纯合子小鼠杂交配繁，得到trp53fl/+；ccnd1cki/+杂合子小鼠；

6、(2)分别将步骤(1)获得的ccnd1cki/+；edl2-creki/+杂合子小鼠自交、trp53fl/+；ccnd1cki/+杂合子小鼠自交，分别得到ccnd1cki/cki；edl2-creki/ki纯合子小鼠和trp53fl/fl；ccnd1cki/cki纯合子小鼠；

7、(3)将步骤(2)获得的ccnd1cki/cki；edl2-creki/ki纯合子小鼠和trp53fl/fl；ccnd1cki/cki纯合子小鼠杂交配繁，得到trp53fl/+；ccnd1cki/cki；edl2-creki/+杂合子小鼠；

8、(4)将步骤(3)获得的trp53fl/+；ccnd1cki/cki；edl2-creki/+杂合子小鼠分别与步骤(2)获得的ccnd1cki/cki；edl2-creki/ki纯合子小鼠和trp53fl/fl；ccnd1cki/cki纯合子小鼠杂交配繁，分别得到代trp53fl/+；ccnd1cki/cki；edl2-creki/ki杂合子小鼠和trp53fl/fl；ccnd1cki/cki；edl2-creki/+杂合子小鼠；

9、(5)将步骤(4)获得的trp53fl/+；ccnd1cki/cki；edl2-creki/ki杂合子小鼠和trp53fl/fl；ccnd1cki/cki；edl2-creki/+杂合子小鼠杂交配繁，得到trp53fl/fl；ccnd1cki/cki；edl2-creki/ki纯合子小鼠，即为食管癌模型小鼠；

10、所述的ccnd1cki/cki纯合子小鼠的构建方法，包含如下步骤：

11、(1)根据小鼠rosa26基因的内含子1设计靶向grna；

12、(2)将骨架载体和小鼠ccnd1 cds序列分别酶切并连接，得到“cag启动子-loxp-pgk-neo-6xsv40pa-loxp-kozak-小鼠ccnd1 cds-wpre-bgh pa”盒即为donor质粒；

13、(3)将含有crrna、tracrna、cas9蛋白和donor质粒的rnp注射复合物通过显微注射系统注射入c57小鼠的同源受精卵细胞内，并将受精卵植入假孕icr母鼠子宫，按照常规方法饲养至其分娩小鼠，得到ccnd1基因过表达阳性f0代小鼠；

14、(4)将步骤(3)获得的ccnd1基因过表达阳性f0代小鼠和野生型c57bl/6j小鼠杂交配繁，获得ccnd1cki/+杂合子小鼠；

15、(4)将步骤(4)获得的ccnd1cki/+杂合子小鼠进行自交配繁，获得ccnd1cki/cki纯合子小鼠；

16、步骤(1)中所述的靶向grna的核苷酸序列如下所示：

17、grna(matching forward strand of gene)：5’-ctccagtctttctagaagat-ggg-3’

18、步骤(3)中所述的rnp注射复合物，通过如下方法获得：

19、①管1溶液的制备：在5.2μl rnase-free水中加入0.8μl 100pmol/μl的crrna，再加入0.6μl 100pmol/μl的tracrna混匀孵育5min，之后再加入0.2μl cas9蛋白混匀，然后金属浴、25℃孵育10min得到管1溶液；

20、②管2溶液的制备：终浓度为15ng/μl的donor质粒；

21、③将管1溶液和管2溶液混合，得到rnp注射复合物；

22、所述的crrna和tracrna的核苷酸序列如下所示：

23、crrna：cuccagucuuucuagaagau-guuuuagagcuaugcuguuuug；

24、tracrna：

25、5’-aaacagcauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcu-3’；

26、所述的trp53fl/fl纯合子小鼠的构建方法，包含如下步骤：

27、将trp53基因敲除trp53fl/+杂合子小鼠进行自交配繁，获得trp53fl/fl纯合子小鼠；

28、所述的食管癌小鼠模型的构建方法，优选还包含如下步骤：

29、(1)将上述1月龄的trp53fl/fl；ccnd1cki/cki；edl2-creki/ki纯合子小鼠使用含甲硝唑、新霉素、氨苄青霉素和万古霉素的饮用水喂饲4周，并正常生长至6月龄；

30、(2)采用含有牙龈卟啉单胞菌的甲基纤维素溶液涂抹于步骤(1)中小鼠的上合磨牙区，每周涂抹2次，涂抹4周；然后继续正常生长至9～14月龄，获得食管癌小鼠模型；

31、所述的含甲硝唑、新霉素、氨苄青霉素和万古霉素的饮用水中甲硝唑、新霉素、氨苄青霉素的浓度分别为0.2g/l，万古霉素的浓度为0.1g/l；

32、所述的含有牙龈卟啉单胞菌的甲基纤维素溶液中羧甲基纤维素的质量分数为2％，牙龈卟啉单胞菌浓度为2×1010个/ml；

33、所述的构建方法在制备防治食管癌产品中的应用；

34、所述的构建方法在制备研究食管癌机理产品中的应用；

35、本发明的原理：

36、如果食管上皮组织的抑癌基因缺失，而癌基因表达增加，其发展成肿瘤的可能性将大大提高。本发明建立了一种通过基因编辑达到成瘤的小鼠模型，能够完整模拟人食管癌发生发展的各个阶段，且该小鼠免疫健全，用于填补小鼠自发形成食管癌模型的空白，解决目前因缺少小鼠食管癌模型而产生的相关难题，为食管癌的肿瘤免疫研究提供合适的研究工具。

37、(1)根据trp53基因的结构域，利用基因编辑技术敲除c57bl/6j(简称c57)小鼠的trp53基因的第2-9号外显子全部编码区dna片段；敲除的后的trp53基因序列如图1所示。

38、(2)根据ccnd1基因的结构域，利用基因编辑技术术在c57小鼠的rosa26安全位点插入ccnd1基因的全部编码区dna片段，ccnd1基因上包括全部外显子序列在内的dna片段，过表达后的ccnd1基因序列如图3所示。

39、(3)根据小鼠生长情况及孟德尔遗传定律，将ccnd1ki/ki纯合子小鼠与edl2-creki/ki纯合子小鼠配繁，得到f3代ccnd1ki/+；edl2-creki/+杂合子小鼠。将trp53fl/fl纯合子小鼠与ccnd1ki/ki纯合子小鼠配繁，得到f3代trp53fl/+；ccnd1ki/+杂合子小鼠。将f3代ccnd1cki/+；edl2-creki/+杂合子小鼠自交及trp53fl/+；ccnd1cki/+杂合子小鼠自交，得到f4代ccnd1cki/cki；edl2-creki/ki纯合子小鼠和trp53fl/fl；ccnd1cki/cki纯合子小鼠。将f4代两种基因型小鼠配繁，得到f5代trp53fl/+；ccnd1cki/cki；edl2-creki/+杂合子小鼠。再将trp53fl/+；ccnd1cki/cki；edl2-creki/+杂合子小鼠分别与ccnd1cki/cki；edl2-creki/ki纯合子小鼠和trp53fl/fl；ccnd1cki/cki纯合子小鼠配繁，得到f6代trp53fl/+；ccnd1cki/cki；edl2-creki/ki杂合子小鼠和trp53fl/fl；ccnd1cki/cki；edl2-creki/+杂合子小鼠。最后将f6代trp53fl/+；ccnd1cki/cki；edl2-creki/ki杂合子小鼠和trp53fl/fl；ccnd1cki/cki；edl2-creki/+杂合子小鼠配繁，得到trp53fl/fl；ccnd1cki/cki；edl2-creki/ki纯合子小鼠为食管癌模型小鼠。

40、(4)本发明选择合适浓度的含有牙龈卟啉单胞菌的甲基纤维素溶液对上述trp53fl/fl；ccnd1cki/cki；edl2-creki/ki纯合子小鼠的上合磨牙区进行涂抹，进而缩短癌变潜伏期。

41、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

42、(1)本发明提供的构建方法构建的食管癌小鼠模型能够使癌症特异性发生于小鼠食管部位，一方面保证了小鼠诱发癌变时其他器官的健康状况，另一方面能够保证使用本发明所述方法构建模型在后期研究过程中的专用性。

43、(2)本发明提供的构建方法构建的食管癌小鼠模型可用于食管癌自发成瘤小鼠模型进行相关实验研究，且不影响小鼠整体生存周期及生殖功能。与先前药物诱导成癌小鼠和裸鼠荷瘤小鼠比较，该模型组织特异性更强，构建模型中食管部位各病变级别均有分部，病变明显，所述模型的小鼠存活周期长，不波及其他器官成癌，且不影响小鼠自身免疫系统，更符合动物实验伦理，方便研究人员使用。

44、(3)本发明提供的构建方法构建的食管癌小鼠模型填补了国内外转基因食管癌小鼠模型的空缺，为国内外食管癌领域重大技术创新，该模型的构建为深入解析食管癌发病机制及肿瘤相关免疫系统功能机制研究提供了技术保障。

45、(4)本发明提供的构建方法构建的食管癌小鼠模型也为寻找预防、治疗食管癌的药物、方法提供了有力的筛选工具。更贴近人体食管鳞癌的自然发生过程，能更好的探索多种诱癌因素的交互作用。