一种ATP6V1E1蛋白Tyr56和Tyr57磷酸化位点的特异性抗体及其制备方法和应用与流程

本发明涉及抗体及其制备，尤其涉及一种atp6v1e1蛋白tyr56和tyr57磷酸化位点的特异性抗体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、v-atpase是大型多亚基复合体，分为两个结构域，通过旋转机制运作。v1结构域是一个650kda的外围复合体，位于膜的细胞质一侧，进行atp水解。v0结构域是一个260kda的膜嵌入复合物，负责将质子从细胞质转运到胞腔或细胞外空间。v1由8个不同的亚基(a、b、c、d、e、f、g、h)组成，而v0包含6个不同的亚基(a、d、e、c、c′和c″)。液泡(v-)atpase复合物由一个外围结构域v1和一个整体结构域v0组成。v1和v0结构域由一个中心柄(由v1的d和f亚基以及v0的d亚基组成)和多个外围柄(由c、e、g、h亚基以及a亚基的n端结构域组成)连接。

2、atp6v1e1(atpase h+transporting v1 subunit e1)是一个蛋白质编码基因。与atp6v1e1相关的疾病包括常染色体隐性皮肤松弛症lic型和常染色体隐性皮肤松弛症li经典型。其相关通路包括胰岛素受体再循环和细胞对刺激的反应。与该基因相关的基因本体(go)注释包括atpase结合和p型质子输出转运体活性。该基因的一个重要旁系亲属是atp6v1e2。

3、目前酵母-哺乳动物杂交复合物的研究表明，亚基d和e可能在控制耦合效率方面发挥作用，但在大多数情况下，这些不同异构体的功能尚不清楚。atp6v1e1是v-atpase v1复合物的亚基，这是一种多亚基酶。v-atpase负责酸化和维持细胞内区室的ph值，在某些细胞类型中，它的作用靶点是质膜，负责酸化细胞外环境。鉴于磷酸化、泛素化等翻译后修饰在细胞信号通路介导的生理和病理过程中发挥着关键作用。atp6v1e1在疾病发生和发展过程中发挥的重要作用，因而进一步研究atp6v1e1蛋白的翻译后修饰具有重要意义。研究发现，atp6v1e1氨基酸序列中的tyr56和tyr57位点是其蛋白磷酸化修饰的位点，在调控atp6v1e1蛋白表达中可能具有重要的作用。抗体是蛋白质功能研究的重要工具，已被广泛用于疾病诊断、治疗等临床应用中，因而一种特异识别atp6v1e1蛋白tyr56和tyr57磷酸化位点的抗体有待于进一步的开发。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种atp6v1e1蛋白tyr56和tyr57磷酸化位点的特异性抗体及其制备方法和应用。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

3、第一方面是提供一种抗原肽，所述抗原肽的氨基酸序列如seq id no.1：tqrlkime(p-y)(p-y)ekkekqiec所示，且其中的tyr氨基酸被磷酸化修饰。

4、第二方面是提供上述抗原肽的应用，所述抗原肽用于制备atp6v1e1蛋白tyr56和tyr57磷酸化位点的特异性抗体。

5、第三方面是提供一种atp6v1e1蛋白tyr56和tyr57磷酸化位点的特异性抗体的制备方法，包括如下步骤：

6、步骤一，人工合成如权利要求1所述的抗原肽；

7、步骤二，利用步骤一合成的抗原肽的n末端与载体蛋白进行偶联，免疫动物并收集抗血清；

8、步骤三，将步骤二收集的抗血清进行鉴定，后对抗体进行纯化处理，即得到所述特异性抗体。

9、进一步地，步骤一中，所述抗原肽的人工合成方法包括：以atp6v1e1蛋白tyr56和tyr57位点为中心，n端毗邻八个atp6v1e1氨基酸序列，c端连接九个氨基酸序列，并采用多肽合成技术进行合成，在氨基酸tyr56和tyr57上添加磷酸化基团。

10、进一步地，步骤二中，免疫动物的方法为用所述抗原肽偶联血蓝蛋白与佐剂联合免疫新西兰大白兔：经颈部、背部皮肤较薄、松弛的部位两侧皮下注射，臀肌与大腿部两侧分别肌肉注射，腰部两侧皮内注射，爪垫注射；免疫次数包括1次引发注射，3-4次加强注射和最后一次抗原直接注射。

11、进一步地，步骤三中，收集的抗血清利用亲和分离-亲和纯化循环技术对抗血清进行纯化，以western blot实验确定抗血清是否能够特异性识别tyr56和tyr57位点磷酸化的atp6v1e1蛋白。

12、更进一步地，所述利用亲和分离-亲和纯化循环技术对抗血清进行纯化的具体步骤包括：首先采用非磷酸化合成肽偶联牛血清白蛋白(bsa)与琼脂糖作为层析柱的填料进行亲和分离除去抗血清中的非磷酸化抗体，得到含磷酸化抗体流出液；接着使用磷酸化合成肽(抗原肽)偶联牛血清白蛋白(bsa)与琼脂糖作为层析柱的填料进行亲和纯化，除去磷酸化抗体中低亲和力的低序列复杂性表位抗体。

13、第四方面是提供一种atp6v1e1蛋白tyr56和tyr57磷酸化位点的特异性抗体，所述特异性抗体由上述制备方法制得。

14、第五方面是提供上述atp6v1e1蛋白tyr56和tyr57磷酸化位点的特异性抗体的应用，所述特异性抗体用于制备检测atp6v1e1蛋白tyr56和tyr57位点磷酸化的试剂盒。

15、本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

16、本发明提供的特异性抗体在实际应用中能够检测atp6v1e1蛋白的翻译后磷酸化修饰情况。

17、本发明提供的特异性抗体实际应用中便于研究atp6v1e1蛋白特定位点磷酸化修饰在特定生物学事件如感染性疾病的相关性。

18、本发明的针对atp6v1e1蛋白tyr56和tyr57位点磷酸化多克隆抗体，有助于研究介导其发生磷酸化作用的激酶，探讨atp6v1e1蛋白的多种生物学功能。

19、本发明提供的特异性抗体有助于探讨atp6v1e1蛋白的磷酸化修饰在结核病发生发展过程中的作用机制，为临床结核病治疗提供潜在的作用靶点。

技术特征：

1.一种抗原肽，其特征在于，所述抗原肽的氨基酸序列如seq id no.1：tqrlki me(p-y)(p-y)ekkekqiec所示，且其中的tyr氨基酸被磷酸化修饰。

2.如权利要求1所述抗原肽的应用，其特征在于，所述抗原肽用于制备atp6v1e1蛋白tyr56和tyr57磷酸化位点的特异性抗体。

3.一种atp6v1e1蛋白tyr56和tyr57磷酸化位点的特异性抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述抗原肽的人工合成方法包括：以atp6v1e1蛋白tyr56和tyr57位点为中心，n端毗邻八个atp6v1e1氨基酸序列，c端连接九个氨基酸序列，并采用多肽合成技术进行合成，在氨基酸tyr56和tyr57上添加磷酸化基团。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤二中，免疫动物的方法为用所述抗原肽偶联血蓝蛋白与佐剂联合免疫新西兰大白兔：经颈部、背部皮肤较薄、松弛的部位两侧皮下注射，臀肌与大腿部两侧分别肌肉注射，腰部两侧皮内注射，爪垫注射；免疫次数包括1次引发注射，3-4次加强注射和最后一次抗原直接注射。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤三中，收集的抗血清利用亲和分离-亲和纯化循环技术对抗血清进行纯化，以western blot实验确定抗血清是否能够特异性识别tyr56和tyr57位点磷酸化的atp6v1e1蛋白。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述利用亲和分离-亲和纯化循环技术对抗血清进行纯化的具体步骤包括：首先采用非磷酸化合成肽偶联牛血清白蛋白与琼脂糖作为层析柱的填料进行亲和分离除去抗血清中的非磷酸化抗体，得到含磷酸化抗体流出液；接着使用磷酸化合成肽偶联牛血清白蛋白与琼脂糖作为层析柱的填料进行亲和纯化，除去磷酸化抗体中低亲和力的低序列复杂性表位抗体。

8.一种atp6v1e1蛋白tyr56和tyr57磷酸化位点的特异性抗体，其特征在于，所述特异性抗体由如权利要求3～7任一项所述制备方法制得。

9.如权利要求8所述atp6v1e1蛋白tyr56和tyr57磷酸化位点的特异性抗体的应用，其特征在于，所述特异性抗体用于制备检测atp6v1e1蛋白tyr56和tyr57位点磷酸化的试剂盒。

技术总结本发明公开了一种ATP6V1E1蛋白Tyr56和Tyr57磷酸化位点的特异性抗体及其制备方法和应用，该特异性抗体由氨基酸序列如SEQ ID NO.1：TQRLKIME(p‑Y)(p‑Y)EKKEKQIEC所示的抗原肽制备。本发明提供的特异性抗体有助于研究介导其发生磷酸化作用的激酶，探讨ATP6V1E1蛋白的多种生物学功能；实际应用中便于研究ATP6V1E1蛋白特定位点磷酸化修饰在特定生物学事件或疾病发生发展过程中的作用机制，为临床结核病的诊断与治疗提供潜在的作用靶点。技术研发人员：陈建霞,刘海鹏,刘峰,郑瑞娟,陈莉,徐俊芳,曹亚娟受保护的技术使用者：上海市肺科医院（上海市职业病防治院）技术研发日：技术公布日：2024/9/29