一种人源IgA肾病模型的制备方法及其应用与流程

本发明涉及生物，尤其涉及一种人源iga肾病模型的制备方法及其应用。

背景技术：

1、iga肾病(iganephropathy，igan)是一种以免疫球蛋白(目前认为主要是iga复合物)在系膜细胞上沉积为主要特征的原发性肾小球疾病，属于最常见的原发性肾小球肾炎，最终损伤肾小球和肾小管的功能。iga肾病成因复杂，一般认为由一些高危基因突变、iga的异常糖基化、黏膜感染以及其它环境因素，共同诱发了iga肾病。

2、iga肾病目前还没有人源的体外模型，市场迫切需要能模拟人iga肾病的模型。目前最常见的研究模型主要是啮齿动物模型。啮齿动物体外模型主要是使用分离的肾系膜细胞进行体外培养。之前的研究表明，通过加热聚合的iga或者igg会增强与体外培养的大鼠肾系细胞的结合，并诱导一系列的免疫反应(gómez-guerrero等，1994，journal ofimmunology)。虽然小鼠的体内与体外模型提供了很多疾病发生的宝贵信息，但是人与啮齿动物的免疫系统，包括iga分子，免疫受体和免疫反应都有巨大的差异。一方面，人源化的小鼠模型在继续开发，还远不完善；另一方面，基于人细胞的体外模型也急需发展。目前人细胞的相关体外模型主要是人肾系膜细胞培养，作为单一的细胞群，缺少肾小管和肾小球的结构，远不能模拟iga肾病肾小球肾小管受损的主要表型，只能模拟系膜细胞在疾病状态下的变化。最新发展的人ipsc来源的肾类器官技术，可以一定程度上模拟肾的初级结构和功能，有很大的疾病建模潜力(low等，2019，cell stem cell)。因此，如何构建人源的iga肾病的模型已成为目前亟待解决的问题。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种人源iga肾病模型的制备方法及其应用。本发明结合了iga/igg的复合溶液刺激方法和人源肾类器官构建及相关检测，制备模拟人iga肾病的体外模型。具体为从人ipsc诱导分化成为肾类器官，加入人源iga/igg的复合溶液模拟免疫球蛋白沉积之后，可以模拟人iga肾病的复杂病理特征，将来可以应用于研究和筛选肾脏主要细胞类型上的潜在靶点。

2、为达此目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种人源iga肾病模型的制备方法，所述制备方法包括：

4、采用人源iga/igg复合溶液处理肾类器官，获得人源iga肾病模型；所述人源iga/igg复合溶液由iga溶液和igg溶液混合并孵育后得到，所得混合液中iga的终浓度为40-60μg/ml，igg的终浓度为40-60μg/ml。所述40-60μg/ml，例如可以是40μg/ml、45μg/ml、50μg/ml、55μg/ml或60μg/ml等。

5、本发明创造性的采用了人源iga/igg复合溶液对肾类器官进行处理，可以发现肾小管形态发生变化，受损程度增加，在检测中表达肾病蛋白nephrin的肾小球足细胞荧光强度降低，而肾基质细胞的标志物sma荧光面积增强，证明iga肾病模型构建成功。iga和igg终浓度是模型构建成功的关键，浓度过低，会导致无法有效造成肾损伤，无法正确构建出模型；而浓度过高，造成过强的损伤，导致类器官失活。

6、优选地，所述混合孵育的温度为60-65℃，时间为130-170min。所述60-65℃例如可以是60℃、61℃、62℃、63℃、64℃或65℃等，所述130-170min，例如可以是130min、140min、150min、160min或170min等。

7、优选地，所述处理肾类器官的时间为4-10天。所述4-10天，例如可以是4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天等。

8、本发明将人源iga/igg复合溶液处理时间为4-10天，小于4天，类器官处理不完全，无法构建iga肾病模型，而处理时间大于10天会导肾类器官的损伤加重，导致类器官失活，导致模型构建失败。

9、优选地，所述处理后将肾类器官在浓度为3-6％ co2的条件下进行培养。所述3-6％，例如可以是3％、4％、5％或6％等。

10、优选地，所述培养采用的基础培养基为95-98份1640培养基、1-3份l-glutamax和1-3份非必需氨基酸溶液。所述95-98份，例如可以是95份、96份、97份或98份等。所述1-3份，例如可以是1份、2份或3份等。

11、本发明中，所述非必需氨基酸溶液包括：l-丙氨酸800-900mg/l、l-谷氨酸1400-1500mg/l、l-天冬酰胺1300-1400mg/l、l-天冬氨酸1300-1400mg/l、l-脯氨酸1100-1200mg/l、l-丝氨酸1000-1100mg/l和甘氨酸700-800mg/l。

12、在本发明的一个具体实施例中，非必需氨基酸溶液采用赛默飞世尔科技公司，货号为11140050的产品。

13、优选地，所述培养的ph为7.8-8.2，例如可以是7.8、7.9、8.0、8.1或8.2等。

14、优选地，所述肾类器官采用包括如下步骤的制备方法制备得到：

15、(a)培养ipsc细胞；

16、(b)诱导分化原线；

17、(c)诱导分化肾源性中胚层细胞；

18、(d)诱导分化肾单位祖细胞；

19、(e)诱导分化肾类器官；

20、(f)肾类器官成熟。

21、优选地，步骤(a)中，采用mtesr plus培养基培养ipsc细胞至生长到30-35％融合度。所述30-35％，例如可以是30％、31％、32％、33％、34％或35％等。

22、优选地，步骤(b)中，采用含有chir99021和sb431542的基础培养基培养步骤(a)获得的ipsc细胞；直到可观测到分化原线。

23、chir99021为gsk-3α/β抑制剂，别称为ct99021，中文名为：6-[2-[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1h-咪唑-2-基)嘧啶-2-基氨基]乙基氨基]吡啶-3-甲腈。sb431542为alk抑制剂，中文名为：4-[4-(1,3-苯并二唑-5-基)-5-(2-吡啶基)-1h-咪唑-2-基]-苯酰胺水合物。

24、优选地，所述基础培养基为95-98份1640培养基、1-3份l-glutamax和1-3份非必需氨基酸溶液。所述95-98份，例如可以是95份、96份、97份或98份等。所述1-3份，例如可以是1份、2份或3份等。

25、本发明中，所述非必需氨基酸溶液包括：l-丙氨酸800-900mg/l、l-谷氨酸1400-1500mg/l、l-天冬酰胺1300-1400mg/l、l-天冬氨酸1300-1400mg/l、l-脯氨酸1100-1200mg/l、l-丝氨酸1000-1100mg/l和甘氨酸700-800mg/l。

26、在本发明的一个具体实施例中，非必需氨基酸溶液采用赛默飞世尔科技公司，货号为11140050的产品。

27、优选地，所述chir99021在基础培养基中的终浓度为8-12μm；所述sb431542在基础培养基中的终浓度为1-3μm。所述8-12μm，例如可以是8μm、9μm、10μm、11μm或12μm等；所述1-3μm，例如可以是，1μm、2μm或3μm等。

28、优选地，步骤(c)中，采用基础培养基继续培养步骤(b)所获得的细胞，直到分化出肾源性中胚层细胞。

29、优选地，步骤(d)中，采用含有chir99021和成纤维细胞生长因子9的基础培养基培养步骤(c)所获得的细胞，直至分化出肾单位祖细胞。

30、优选地，所述chir99021在基础培养基中的终浓度为1-5μm；所述成纤维细胞生长因子9在基础培养基中的终浓度为40-60ng/ml。所述1-5μm，例如可以是1μm、2μm、3μm、4μm或5μm等。所述40-60ng/ml，例如可以是40ng/ml、45ng/ml、50ng/ml、55ng/ml或60ng/ml等。

31、优选地，步骤(e)中，采用含有浓度为40-60ng/ml成纤维细胞生长因子9的基础培养基培养步骤(d)所获得的细胞，诱导分化培养2-3天后得到肾类器官，将肾类器官转移到transwell进行气液交换培养，并在下腔加入基础培养基，再次培养1-2天。所述40-60ng/ml，例如可以是40ng/ml、45ng/ml、50ng/ml、55ng/ml或60ng/ml等。

32、优选地，在步骤(g)中，将步骤(e)所获得的肾类器官在transwell下腔加入基础培养基，每天换液，直至肾类器官成熟。

33、本发明在不同阶段采用多种组合的培养基，在上述浓度范围内能够分阶段分化出肾类器官的不同细胞及结构，上述分化方式遵循细胞生长机制，能够在获得优质的肾类器官的情况下，进一步缩短分化时间，上述方法可快速获得大量肾类器官，为构建iga肾病模型提供基础材料。

34、优选地，所述肾类器官采用包括如下步骤的制备方法制备得到：

35、(a)诱导分化原线；

36、(b)诱导分化肾源性中胚层细胞；

37、(c)诱导分化肾单位祖细胞；

38、(d)诱导分化肾小管和肾小球；

39、(e)调节肾小管远端和近端比例；

40、(f)肾类器官进行气液交换；

41、(g)肾类器官继续分化；

42、(h)肾类器官分化成熟。

43、优选地，步骤(a)中，采用含有chir99021的基础培养基培养ipsc细胞2-4天。

44、优选地，所述chir99021在基础培养基中的终浓度为5-15μμ。例如可以是5μμ、8μμ、10μμ、12μμ或15μμ等。

45、优选地，步骤(b)中，采用基础培养基培养步骤(a)所获得的细胞，直到分化出肾源性中胚层细胞。

46、优选地，步骤(c)中，采用含有chir99021和成纤维细胞生长因子9的基础培养基培养步骤(b)所获得的细胞，直到分化出肾单位祖细胞。

47、优选地，所述chir99021在基础培养基中的终浓度为1-5μμ，所述成纤维细胞生长因子9在基础培养基中的终浓度为40-60ng/ml。所述1-5μm，例如可以是1μm、2μm、3μm、4μm或5μm等。所述40-60ng/ml，例如可以是40ng/ml、45ng/ml、50ng/ml、55ng/ml或60ng/ml等。

48、优选地，步骤(d)中，采用含有成纤维细胞生长因子9的基础培养基培养步骤(c)所获得的细胞，直至分化成肾小管和肾小球。

49、优选地，所述成纤维细胞生长因子9在基础培养基中的终浓度为40-60ng/ml。所述40-60ng/ml，例如可以是40ng/ml、45ng/ml、50ng/ml、55ng/ml或60ng/ml等。

50、优选地，步骤(e)中，采用含有chir99021和成纤维细胞生长因子9的基础培养基培养骤(d)所获得的细胞，培养2-4天。所述培养2-4天，例如可以是2天、3天或4天等。

51、优选地，所述chir99021在基础培养基中的终浓度为1-3μμ；所述成纤维细胞生长因子9在基础培养基中的终浓度为40-60ng/ml。所述1-3μm，例如可以是1μm、2μm或3μm等。所述40-60ng/ml，例如可以是40ng/ml、45ng/ml、50ng/ml、55ng/ml或60ng/ml等。

52、优选地，步骤(f)中，将步骤(d)获得的肾类器官转移到transwell中进行1-2天的气液交换，在transwell下腔加入含有chir99021和成纤维细胞生长因子9的基础培养基。

53、优选地，所述chir99021在基础培养基中的终浓度为1-3μμ，所述成纤维细胞生长因子9在基础培养基中的终浓度40-60ng/ml。所述1-3μm，例如可以是1μm、2μm或3μm等。所述40-60ng/ml，例如可以是40ng/ml、45ng/ml、50ng/ml、55ng/ml或60ng/ml等。

54、优选地，步骤(g)中，将步骤(f)获得的肾类器官进行继续分化，transwell下腔每天更换成含有成纤维细胞生长因子9的基础培养基，培养2-3天。

55、优选地，所述成纤维细胞生长因子9在基础培养基中的终浓度为40-60ng/ml。所述40-60ng/ml，例如可以是40ng/ml、45ng/ml、50ng/ml、55ng/ml或60ng/ml等。

56、优选地，步骤(h)中，将步骤(g)获得的肾类器官在transwell下腔加入基础培养基，每天换液，直至肾类器官成熟。

57、本发明采用两种肾类器官的培养方式，均可以培养出优质的肾类器官，并且均可成功构建iga肾病模型，为iga肾病模型的制备提供大量基础材料。

58、第二方面，本发明提供了第一方面所述的iga肾病模型的制备方法制备得到的iga肾病模型。

59、本发明创造性地采用iga/igg复合溶液对肾类器官进行处理，构建出的iga肾病模型，其损伤效果明显，肾小管形态产生变化，并且本发明采用的是人源的肾类器官，能够在一定程度上模拟人体肾脏。本发明制备的iga肾病模型可以模拟除了系膜细胞增生之外的更多的表型，如肾小球足细胞的损伤和肾小管细胞的损伤，更接近人体的生理状态。

60、第三方面，本发明提供了第二方面所述的iga肾病模型在制备探究iga肾病的发病机制或细胞发展的产品中的应用。

61、第四方面，本发明提供了第二方面所述的iga肾病模型在制备筛选用于治疗iga肾病的药物的产品的应用。

62、与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

63、1.本发明创造性地采用iga/igg复合溶液对肾类器官进行处理，可以发现肾小管形态发生变化，受损程度增加，在检测中nephrin的荧光强度不断降低，而sma荧光面积不断增强，成功构建iga肾病模型。该iga肾病模型不仅可以模拟系膜细胞增生，还可以模拟肾小球足细胞的损伤和肾小管细胞的损伤，更接近人体的生理状态，可以应用于研究和筛选肾脏主要细胞类型上的潜在靶点。

64、2.本发明采用两种肾类器官的制备方法，均成功制备出肾类器官，上述方法可快速高效的获得肾类器官，为iga肾病模型提供基础材料，且制备出的肾类器官可以成功构建出iga肾病模型。