新型拮抗性抗TNFR2抗体分子的制作方法

本发明涉及新型拮抗性抗体分子，所述新型拮抗性抗体分子与靶细胞上的肿瘤坏死因子受体2(tnfr2)特异性结合并且由此阻断配体tnf-α与tnfr2结合并且还阻断tnfr2信号传导，所述抗体分子还通过其fc区与fc受体结合。本发明还涉及其在医学中，如在治疗癌症或由细胞内病原体引起的感染中的用途。

背景技术：

1、肿瘤坏死因子(tnf)受体2(tnfr2、tnfr-2或tnfrii)，也被称为肿瘤坏死因子受体超家族成员1b(tnfrsf1b)和cd120b，是结合肿瘤坏死因子-α(tnf-α或tnfα)的膜受体。其发现于即t细胞、单核细胞和巨噬细胞的表面并且可以通过核因子κb(nf-κb)激活tnfr2受体表达细胞的增殖。值得注意的是，tnfr2在癌症中并且具体地在肿瘤浸润免疫细胞，例如调节性t细胞(treg)、cd8+细胞毒性效应t细胞和不同的骨髓细胞亚群中被高度上调。

2、据讨论，tnfr2已成为癌症免疫疗法的有希望的靶标并且已被描述为是在具体地肿瘤内treg和许多人类肿瘤细胞的表面上高度表达的(williams gs等人,《肿瘤靶标(oncotarge)》2016；7(42):68278–68291；vanamee es等人,《分子医学趋势(trends inmolecular medicine)》,2017,第23卷,第11期,1037-1046；《免疫学前沿(frontiers inimmunology)》,2017年11月|第8卷|第1482条；《科学信号(sci signal.)》2018年1月2日；11(511)。

3、调节性t细胞(其可以被称为treg细胞、treg或treg，并且其先前被称为抑制t细胞或抑制性调节性t细胞)构成能够抑制正常和病理性免疫环境中的其它免疫细胞的t细胞亚群。treg是cd4阳性细胞(cd4+细胞)。还存在不是treg的其它cd4+t细胞；然而，treg可以与非treg cd4+细胞分离，因为treg还是foxp3阳性的(foxp3+)，而非treg cd4+细胞是foxp3阴性的(foxp3-)。treg也可以与非treg cd4+细胞分离，因为treg还是cd25+cd127neg/low，而非treg cd4+细胞是cd25-cd127+或cd25+cd127。

4、还与以下结合对tnfr2进行了讨论：自身免疫疾病(faustman dl等人，《免疫学前沿(front immunol)》2013；4:478；《临床与转化免疫学(clin transl immunology)》2016年1月8日；5(1)；《神经科学杂志(j neurosci.)》2016年5月4日；36(18):5128-43)和炎性疾病(ait-ali d等人,《内分泌学(endocrinology)》2008年6月；149(6):2840-52；《科学报告(sci rep.)》2016年9月7日；6:32834)。

5、先前也已经描述了不同类型并且具有各种特性的抗tnfr2抗体。例如，williams等人(《肿瘤靶标》2016年10月18日；7(42):68278-68291)描述了配体阻断激动性抗体和配体非阻断激动性抗体两者。

6、wo 2014/124134公开了tnfr2激动剂的用途，如激动性抗tnfr2抗体和/或用于体外产生富含cd4+cd25hi treg的组合物的nf-κb激活子。据说所述组合物可用于治疗患者的免疫性病症或感染性疾病。wo 2014/124134进一步公开了可以结合tnfr2的一个或两个表位的tnfr2拮抗剂抗体。这些表位中的第一个表位包含序列qtaqmccskcspgqhakvfc，并且第二个表位包含位于人tnfr的氨基酸中的一个特定位置中的一个特定氨基酸；第二表位可以包含序列rlcaplrkcrpgf。据说此类tnfr2拮抗剂可用于产生富含淋巴细胞并且耗尽treg的组合物。在源自此pct申请的授权的美国专利第9 821 010号中，已将拮抗性抗体指定为与序列kqegcrlcaplrkcrpgfgv内的表位，如包括序列rlcaplrkcrpgf的表位选择性地结合。据说tnfr2拮抗剂和使用tnfr2拮抗剂产生的组合物可用于治疗如癌症等增生性病症或感染性疾病。

7、wo 2016/187068公开了能够拮抗肿瘤坏死因子受体超家族成员，如tnfr2的抗体。据说所述抗体可用于调节treg，如可用于以治疗增生性病症和感染性疾病的免疫疗法。具体地，其公开了与人tnfr2的特异性表位结合的拮抗性tnfr2抗体，并且其呈现了此类抗体的许多特异性cdr序列。据说wo 2016/187068中的数据证明了拮抗性tnfr2抗体的fab区与tnfr2的特异性结合可能负责调节treg细胞生长，而不是这些抗体的fc区的非特异性结合。

8、wo 2017/040312公开了抗tnfr2抗体以及具体地能够促进tnfr2信号传导并且对treg的扩增或增殖具有影响的激动性抗tnfr2抗体。wo 2017/040312公开了与包括序列kcspg的表位特异性结合但不与包括序列kcrpg的表位特异性结合，因此排除了以上描述的us 9 821 010的抗体或者可替代地不与另一tnfr超家族成员结合的抗体。据说所述激动性抗体可用于治疗免疫性疾病。wo 2017/040312进一步阐述了人tnfr2的完整序列。

9、wo 2017/083525讨论了包括抗tnfr2抗体的药理组合物以及其在治疗与tnf-α和/或tnfr2相关联的病症，如癌症中的用途。wo 2017/083525进一步讨论了包括对于与fcγ受体的结合以及对treg的扩增的抑制无效的人igg1 fc结构域的抗体。

10、wo 2017/197331公开了包括具有特定序列的互补决定区-重链3的拮抗性tnfr2抗体并且讨论了减少或抑制treg的增殖和/或对t效应细胞的增殖的抑制。

11、fc受体是发现于免疫效应细胞的细胞表面上的膜蛋白，所述免疫效应细胞包含单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和自然杀伤细胞以及b淋巴细胞。名称衍生自其对抗体的fc区的结合特异性。fc受体发现于细胞膜上–所述细胞膜另外被称为质膜或细胞质膜。fc受体可以被细分为活化fcγr和抑制性fcγr，所述活化fcγr和抑制性fcγr已知通过聚集的免疫球蛋白g fc's的结合来协调地调节细胞活化，以及通过细胞内itam或itim基序将活化或抑制性信号传输到细胞中。聚集的免疫球蛋白或免疫复合物的fcr结合可以介导抗体进入细胞的内化并且可能导致抗体介导的吞噬、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或抗原呈递或交叉呈递。已知fcr还介导或增强抗体结合的细胞表面受体的交联。已知此交联是激活靶向的细胞的信号传导的一些(li等人,2011“抑制性fcγ受体连接驱动激动性cd40抗体的佐剂和抗肿瘤活性(inhibitoryfcgamma receptor engagement drives adjuvant and anti-tumor activities ofagonistic cd40 antibodies)”,《科学(science)》,333:1030-4；white等人,2011“与fcγriib的相互作用对于抗cd40单克隆抗体的激动活性至关重要(interaction withfcgammariib is critical for the agonistic activity of anti-cd40 monoclonalantibody)”,《免疫学杂志(j immunol)》,187:1754-63)，但不是所有(richman等人,2014,“抗人cd40单克隆抗体疗法在不进行fcr交联的情况下是有效的(anti-human cd40monoclonal antibody therapy is potent without fcr crosslinking)”,《肿瘤免疫学(oncoimmunology)》,3:e28610)抗体能力所需要的，并且可能是也可能不是达到治疗效果所需要的。

12、fc受体的亚组是对igg抗体具有特异性的fcγ受体(fcγ受体、fcγr(fcgammar)或fcγr)。存在两种类型的fcγ受体：活化fcγ受体(也表示为活化性fcγ受体)和抑制性fcγ受体。活化和抑制性受体分别通过基于免疫受体酪氨酸的活化基序(itam)或基于免疫受体酪氨酸的抑制性基序(itim)传输其信号。在人类中，fcγriib(cd32b)是抑制性fcγ受体，而fcγri(cd64)、fcγriia(cd32a)、fcγriic(cd32c)和fcγriiia(cd16a)是活化fcγ受体。fcγgriiib是在中性粒细胞上表达的gpi连接的受体，所述gpi连接的受体缺乏itam基序但通过其交联脂质筏并与其它受体连接的能力而也被视为是活化性的。在小鼠中，活化受体是fcγri、fcγriii和fcγriv。

13、众所周知，抗体可以通过与fcγ受体的相互作用来调节免疫细胞活性。具体地，抗体免疫复合物如何调节免疫细胞活化是通过其活化和抑制性fcγ受体的相对连接来确定的。不同抗体同种型以不同亲和力与活化和抑制性fcγ受体结合，从而产生不同的a:i比率(活化:抑制比率)(nimmerjahn等人；《科学》2005年12月2日；310(5753):1510-2)。

14、通过与抑制性fcγ受体结合，抗体可以抑制、阻断和/或下调效应细胞功能。通过与抑制性fcγr结合，抗体可以通过在靶细胞上聚集抗体靶向的信号传导受体来进一步刺激细胞活化(li等人,2011,“抑制性fcγ受体连接驱动激动性cd40抗体的佐剂和抗肿瘤活性”,《科学》,333:1030-4；white等人,2011“与fcγriib的相互作用对于抗cd40单克隆抗体的激动活性至关重要”,《免疫学杂志》,187:1754-63；white等人2014“激动性cd40抗体在淋巴瘤疗法中的fcγ受体依赖性可以通过抗体多聚化来克服(fcgamma receptordependency of agonistic cd40antibody in lymphoma therapy can be overcomethrough antibody multimerization)”,《免疫学杂志》,193:1828-35)。

15、通过与活化fcγ受体结合，抗体可以激活效应细胞功能并且由此触发以下机制，如抗体依赖性细胞毒性(adcc)、抗体依赖性细胞吞噬(adcp)、细胞因子释放和/或抗体依赖性内吞以及在中性粒细胞的情况下的netosis(即net中性粒细胞细胞外陷阱的活化和释放)。抗体与活化fcγ受体的结合还可能导致某些活化标志物，如cd40、mhcii、cd38、cd80和/或cd86的增加。

16、具体地本发明人发表的最新数据表明，分别与活化和抑制性fcγr的结合的cd8 t细胞激动剂和treg耗竭型抗4-1bb抗体在治疗功效方面的关键性和差异性依赖性(buchan等人,“共刺激性受体4-1bb的抗体通过t调节性细胞耗竭以及对cd8 t细胞效应功能的促进来增强抗肿瘤免疫力(antibodies to costimulatory receptor 4-1bb enhance anti-tumor immunity via t regulatory cell depletion and promotion of cd8 t celleffector function)”,《免疫学(immunity)》201849(5):958-970)。此外并且至关重要的是，同时施用分别在与活化和抑制性fcγr结合方面优化的cd8 t细胞激动剂和treg耗竭型抗4-1bb抗体损害了治疗活性。这些数据表明了开发适当地且定制地连接活化和抑制性fcγr，以最大化具有独特作用机制的抗体的治疗活性的抗体的关键重要性。同时，其表明了活化和抑制性fcγr的次优连接可能会严重降低治疗功效。

17、这些数据令人惊讶，因为其与对其它tnfsr成员的抗体，值得注意地是免疫刺激性抗cd40抗体的发现相反，所述其它抗体显示出对抑制性而非活化fcγr的连接的专性需要(li等人,2011,“抑制性fcγ受体连接驱动激动性cd40抗体的佐剂和抗肿瘤活性”,《科学》,333:1030-4；white等人,2011“与fcγriib的相互作用对于抗cd40单克隆抗体的激动活性至关重要”,《免疫学杂志》,187:1754-63)。综上所述，这些结果表明fcγr依赖性在同一受体超家族的不同靶标的抗体之间以及甚至在相同靶标的不同类型的抗体之间，可能会以不容易预测的方式发生变化，但是对于在开发用于治疗用途的抗体时进行理解和利用可能是至关重要的。

技术实现思路

1、在导致本发明以及并行发明的工作中，标识了两种主要不同组的具有强大治疗作用以及不同特性和作用机制的抗tnfr2抗体。

2、发明人首先识别出阻断tnf-α与tnfr2受体的结合的拮抗性抗tnfr2抗体的强大治疗活性。对于体内治疗活性，此类抗体的活性被示出为取决于fcγr相互作用，以及具体地与活化性fcγr的结合。发现此组或类别的强大抗tnfr2治疗药剂的特征在于1)明显阻断并抑制tnf-α(配体)诱导的tnfr2信号传导，以及2)依赖于fcγr连接，从而最大得益于对抑制性fcγr进行活化的连接的活性。

3、发明人然后标识了在体内具有同样强大的治疗活性的不同组的抗tnfr2抗体，但是其特性在许多方面与构成第一组和本发明的拮抗性阻断类型的tnfr2抗体的特性相反。此第二组的抗tnfr2抗体不依赖于tnfr2信号传导对治疗活性的tnf-α阻断或抑制，而是其特征在于对tnfr2信号传导的强烈激活。与第一组的阻断抗体进一步相反，第二组的激动性抗体未示出对抗体:fcγr连接的专性依赖性，即使利用fcγr:连接抗体变体提高了其活性也是如此。与第一组拮抗性且阻断抗体进一步相反的是，第二组激动性抗体在抗体变体中示出最大活性，与活化fcγr相比对抑制剂的结合增强。

4、本发明涉及第一组抗tnfr2抗体，即涉及通过与tnfr2特异性结合而阻断tnf-α与tnfr2的结合并且还阻断tnfr2的信号传导的拮抗性抗体分子。这些抗体分子还具有与fc受体结合的fc区，所述fc区可用于赋予tnfr2阳性细胞的fcγr依赖性消除或功能性调节，如treg耗竭或肿瘤相关巨噬细胞的调节。

5、在下面的实例中使用了属于第二组的拮抗性抗体，以用于与本发明的激动性阻断tnfr2抗体分子进行比较。在实例中，还使用了具有某些特性的与第一组或第二组或两者的抗体相似的其它抗体以进行比较，如以下进一步解释的。

6、因此，本发明涉及拮抗性抗体分子，所述拮抗性抗体分子与靶细胞上的tnfr2特异性结合并且由此阻断tnf-α与tnfr2结合并且还阻断tnfr2信号传导，并且其中所述抗体分子还通过其fc区与fcγ受体结合。

7、本发明还涉及此类新型拮抗性且阻断抗tnfr2抗体分子的具体实例。

8、本发明还涉及编码以上抗体分子中的至少一种抗体分子的分离的核苷酸序列。

9、本发明还涉及包括以上核苷酸序列中的至少一种核苷酸序列的质粒。

10、本发明还涉及包括以上核苷酸序列或质粒中的至少一种的病毒。

11、本发明还涉及包括以上核苷酸序列之一，或以上质粒之一，或以上病毒之一的细胞。

12、本发明还涉及用于医学的以上抗体分子、核苷酸序列、质粒、病毒和/或细胞。

13、本发明还涉及用于治疗癌症或由细胞内病原体引起的感染的以上抗体分子、核苷酸序列、质粒、病毒和/或细胞。

14、本发明还涉及用于治疗癌症或由细胞内病原体引起的感染的以上抗体分子、核苷酸序列、质粒、病毒和/或细胞。

15、本发明还涉及药物组合物，所述药物组合物包括以下或由以下组成：以上抗体分子、核苷酸序列、质粒、病毒和/或细胞中的至少一种以及任选地药学上可接受的稀释剂、载体、媒剂和/或赋形剂。此类药物组合物可以用于治疗癌症或由细胞内病原体引起的感染。

16、本发明还涉及用于治疗患者的癌症或由细胞内病原体引起的感染的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的所述以上抗体分子、核苷酸序列、质粒、病毒和/或细胞中的至少一种。

17、本发明还涉及抗体分子、供使用的抗体分子、分离的核苷酸序列、供使用的分离的核苷酸序列、质粒、供使用的质粒、病毒、供使用的病毒、细胞、供使用的细胞、用途、药物组合物和治疗的方法，如本文参考所附说明书、实例和/或附图所描述的。

18、因此，本发明涉及拮抗性抗体分子，所述拮抗性抗体分子与靶细胞上的tnfr2特异性结合并且由此阻断tnf-α与tnfr2结合并且还阻断tnfr2信号传导，并且其中所述抗体分子还通过其fc区与fcγ受体结合。

19、本文公开的拮抗性抗体分子阻断tnf-α与tnfr2的结合以及tnfr2信号传导两者。拮抗性抗体分子阻断tnf-α与tnfr2的结合在本文中意指与受体tnfr2结合的抗体分子由此阻止配体tnf-α与同一受体结合。在实例3中对此进行了更详细的说明。本文公开的拮抗性抗体分子阻断tnfr2信号传导意指其阻断tnfr2介导的细胞活化。已经清楚地表明，通过tnfr2进行的tnf-α介导的信号传导开始信号传导级联，所述信号传导级联终止于核转录因子nfκb的活化(thommesen等人“nfκb的tnf受体1介导的活化与tnf受体2介导的活化之间的明显差异(distinct differences between tnf receptor 1-and tnf receptor 2-mediated activation of nfkappab)”,《生物化学与分子生物学杂志(j biochem molbiol.)》2005年5月31日；38(3):281-9；yang等人“tnf-tnf受体2信号在调节性t细胞中的作用以及其治疗意义(role of tnf-tnf receptor 2signal in regulatory t cells andits therapeutic implications)”《免疫学前沿》2018年4月19日；9:784)。这进而导致细胞的活化和几种促炎因子的合成，几种促炎因子之一是nk细胞中的ifn-γ(liu等人“炎症中的nf-κb信号传导(nf-κb signaling in inflammation)”《信号转导与靶向治疗(signaltransduct target ther.)》2017；2.pii:17023；tato等人“nf-κb家族成员在调节nk细胞增殖和ifn-γ的产生中的相反作用(opposing roles of nf-kappab family members inthe regulation of nk cell proliferation and production of ifn-gamma)”《国际免疫学(int immunol.)》2006年4月；18(4):505-13)。在本文中术语tnfr2信号传导和tnfr2活化可互换使用。

20、抗体分子与tnfr2特异性结合。众所周知的是，抗体与限定的靶分子或抗原特异性结合或相互作用，并且这意味着抗体优先地且选择性地结合其靶标而不是非靶标的分子。“特异性结合tnfr2的抗体分子”或“tnfr2特异性抗体分子”意指以剂量依赖性方式结合tnfr2蛋白但不与无关蛋白结合的抗体。另外，相同的抗体结合内源性地表达tnfr2的细胞，并且此结合可以通过将相同细胞与市售的多克隆tnfr2抗体试剂一起预培育来阻断，这示出了当tnfr2被多克隆试剂掩盖时可能无法检测到非特异性结合。这在实例2中示出。

21、特异性结合tnfr2的抗体分子(或抗tnfr2抗体分子)是指与tnfr2的细胞外结构域中的至少一个表位特异性结合的抗体分子。细胞表面抗原和表位是免疫学或细胞生物学的技术人员容易理解的术语。

22、评估蛋白质结合的方法是生物化学和免疫学的技术人员已知的。技术人员将理解，那些方法可以用于评估抗体与靶标的结合和/或抗体的fc区与fc受体的结合；以及相对强度或特异性，或那些相互作用中的抑制或预防或降低。可以用于评估蛋白质结合的方法的实例是，例如，免疫测定、biacore、蛋白质印迹(western blot)、放射免疫测定(ria)和酶联免疫吸附测定(elisa)以及流式细胞术(facs)。(对于关于抗体特异性的讨论，参见《基础免疫学(fundamental immunology)》第二版,雷文出版社(raven press),纽约(new york)第332-336页(1989))。

23、表达根据本发明的阻断抗体所结合的tnfr2的靶细胞包含免疫细胞和/或肿瘤细胞，如以上和以下讨论的。根据本发明的拮抗性抗体分子与tnfr2结合的作用可以是患病组织中的细胞组成发生变化。组成的此变化可以通过患病组织中的tnfr2表达细胞的数量和/或频率的改变而发生。例如，对癌症的影响包含肿瘤内t细胞数量增加，cd8+t细胞/treg(即cd8+t细胞数量与treg数量)的比率增加和/或与抗肿瘤相关联的骨髓细胞数量增加，这与促肿瘤特性相反。这在实例5进行了说明。在一些实施例中，这些作用导致组织treg的数量减少，cd8+效应t细胞的数量增加以及组织骨髓细胞亚群的组成改变。实例5中详细示出了在体内治疗性发明后，用根据本发明的拮抗性抗体分子的替代物(3-f10)对组织中的tnfr2表达细胞进行调节。为了测试根据本发明的人拮抗性抗体分子的相似作用，可以小鼠中执行在已经在小鼠tnfr2中缺失并已使对人tnfr2为转基因的类似实验。可替代地并且优选地，尽管需要大量的时间和资源，但是与先前针对cd40和hfcγr所描述的相比，可以以类似方式产生对人tnfr2和人fcγr为转基因的动物。(dahan等人,2016,“激动性人抗cd40单克隆抗体的治疗活性需要选择性fcγr连接(therapeutic activity of agonistic,humananti-cd40 monoclonal antibodies requires selective fcgammar engagement)”,《癌细胞(cancer cell)》,29:820-31)。然后可以类似地使用此人源化tnfr2 fcγr小鼠来测试根据本发明的人拮抗性抗体分子的类似作用。

24、患病组织在此上下文中意指肿瘤组织(即肿瘤微环境中的所有细胞，包含肿瘤细胞、免疫细胞、内皮细胞和基质细胞)或受细胞内病原体影响的组织。

25、为了决定抗体分子是阻断还是不阻断配体与tnfr2的结合，可能的是使用elisa测定确定在tnfr2特异性抗体存在下，与固定化的tnfr2受体结合的tnf-α配体的量。阻断抗体将阻止配体tnf-α与固定化的受体tnfr2结合。在以下实例3中对此进行了更详细的说明和解释。

26、根据本发明的阻断抗体分子是另外能够拮抗tnfr2信号传导的完全阻断剂。

27、完全阻断剂在本文中被定义为与在仅同种型对照抗体分子存在下的tnf-α结合相比，将tnf-α与tnfr2的结合降低多于多98％，即至多100％的抗体分子。同种型对照抗体是针对在研究下在测定中不以任何形式存在的蛋白质或其它结构提出的抗体。同种型对照理想地具有与比较抗体相同的框架，但至少相同的fc部分。这对本领域的技术人员而言是众所周知的。在本文所述的实例中，同种型对照具有相同的构架、相同的fc部分，并且对荧光素异硫氰酸(fitc)具有特异性。在一些实施例中，完全阻断剂将的tnf-α结合降低了多于99.5％。

28、其它类型的阻断剂是部分阻断剂和弱阻断剂。如本文所用，部分阻断剂是与在仅同种型对照抗体分子的存在下的tnf-α结合相比，将tnf-α与tnfr2的结合降低60-98％(例如，降低60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％以及其间的所有十进制数)的抗体分子，并且弱阻断剂是与在仅同种型对照抗体分子存在下的tnf-α结合相比，将tnf-α与tnfr2的结合降低少于60％，如50-59.9％(或50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59或59.9％以及其间的所有十进制数)的抗体分子。

29、相反，非阻断tnfr2抗体分子是与在仅同种型对照抗体分子存在下的tnf-α结合相比，将tnf-α与tnfr2的结合降低少于50％的抗体分子。在一些实施例中，这在高剂量单点elisa或剂量滴定elisa中得到确定，如实例3以及图6和7中示出的。

30、在实例中使用了部分阻断、弱阻断和非阻断抗体，以用于与本发明的拮抗性阻断抗体分子进行比较。

31、几种性质和特征可以奠定和(共同)确定抗体的生物活性。除了阻断配体与受体结合的能力之外，重要的此类性质包含调节受体信号传导，即激动或拮抗受体信号传导的抗体能力，以及对用于赋予治疗活性的fcγr相互作用的抗体依赖性。

32、首先表征了完全阻断、部分阻断和非阻断抗体调节tnfr2信号传导的能力。标识了两个极端。

33、在第一个极端中，标识了完全阻断配体与tnfr2的结合，阻断tnf-α诱导的tnfr2信号传导，并且在与细胞内源性表达的tnfr2结合时本身并不诱导信号传导的抗体。此组配体阻断拮抗性抗体形成本发明的基础。

34、在另一极端中，标识了不阻断配体与tnfr2的结合，但在与tnfr2结合时内源性表达的细胞激动受体的抗体。此第二组抗体构成了单独发明并且包含在此以用于比较。

35、由部分阻断激动性、部分阻断非激动性和完全阻断非拮抗性定义的抗体和类别被另外标识为展示出抗tnfr2抗体的复杂生物学和巨大异质性，这清楚地展示了本发明的抗体形成独特的组。

36、为了确定抗体是否具有激动剂活性或拮抗活性，可能的是使用如实例4中所述的自然杀伤(nk)细胞测定。简而言之，已经描述了nk细胞利用分泌ifn-γ对il-2和il-12刺激作出反应。可溶性tnf-α是内源性地产生的并且以鲁棒但次优的浓度(约20-100pg/ml)存在，用于tnfr2信号传导，这意味着ifn-γ可以通过调节tnfr2信号传导来增加和减少。因此，外源性地添加tnfr2信号传导最优浓度的tnf-α增强了此测定中的ifn-γ浓度，与激动剂抗tnfr2抗体一起进行的培育也是如此(图8的c)。相反，与抗tnf-α抗体或本文所述的配体阻断拮抗剂抗体共同培育降低了此测定中的ifn-γ释放。因此，此测定可以用于标识抗tnfr2抗体的激动剂或拮抗剂活性或抗tnfr2抗体的缺乏。(tnfα通过tnfr2增强了细胞因子诱导的nk细胞ifnγ产生。almishri w.等人,《先天免疫杂志(j innate immun.)》2016；8:617-629)。因此，在此实验设置中，拮抗性抗体防止tnfr2表达细胞中的tnf-α诱导的信号传导并且在与tnfr2受体结合时自身并不刺激所述tnfr2受体。具体地，在此测定中，拮抗性抗体在与以上提及的nk细胞结合后不增加ifn-γ释放而是抑制ifn-γ释放。如图8中示出的，本发明所述的完全阻断抗体未诱导tnfr2信号传导，而是降低了此含tnf-α的nk细胞测定中的tnfr2信号传导，导致释放的ifn-γ的量降低。如图8实例4中指示的，本发明的抗体因此可以被分类为配体阻断拮抗性抗tnfr2抗体。使用此测定，将拮抗性抗体定义为导致ifn-γ释放降低>30％(例如35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％)的抗体，条件是此培养物中的基础tnf-α水平为至少20pg/ml。由于此测定使用来自pbmc供体的原代细胞，因此需要包含至少4个供体，并且均值应根据所有供体计算。来自在计算均值时要包含的每个供体的细胞必须对与利用同种型对照进行的处理相比ifn-γ水平增加>100％(>2倍)的阳性对照(可溶性tnf-α)处理作出反应。

37、拮抗剂活性也可以使用il-2介导的记忆性t细胞的活化来证明。活化在此通过上调t细胞活化标志物cd25来测量。使用此测定，添加非阻断激动性tnfr2抗体进一步地上调cd25表达，而根据本发明的阻断拮抗性tnfr2抗体则导致与同种型对照相比较低的cd25表达。对于本发明的人抗体以及鼠替代抗体而言确实如此，并示出在实例4中。

38、除了与tnfr2结合并且由此阻断tnf-α结合和信号传导以外，根据本发明的抗体分子还与fcγ受体结合。在小鼠癌症实验模型中使用有效地连接或不有效地连接fcγr结合的抗体变体证明了对属于本发明的用于得到治疗功效的tnf-α阻断拮抗性组的抗体的抗tnfr2抗体的fcγr相互作用的专性依赖性。此配体阻断拮抗性抗体对体内治疗活性的专性依赖性，以及其为了最大治疗性体内活性而相对于抑制性fcγr优先结合/连接活化性fcγr示出在实例5中。在此实例中包含了证明激动剂非阻断抗tnfr2抗体的fcγr无关的体内活性，以及其为了最大治疗性活性而相对于活化fcγr差异性地优先连接抑制性fcγr的数据，以用于仅比较和对比目的。总的来说，数据证明了可以产生几种类型的抗tnfr2抗体。此外，数据证明，哪些抗体变体将是治疗最有效的，是否其依赖于阻断、激动剂或拮抗剂(外部或固有)性质以及其是依赖于还是不依赖于fcγr连接或在相关于与活化或抑制性fcγ受体优先/强结合的抗体格式中最有效并不是不重要的并且可能无法预测。

39、小鼠与人fcγr系统之间的相对高的同源性解释了物种之间保守的fcγr介导的机制的许多一般方面。然而，小鼠和人igg亚类在其对其同源fcγr的亲和力方面有所不同，使其在将小鼠系统中的fcγr介导的观察转化为基于人igg的治疗剂以选择示出与人活化与抑制性fcγr的适当结合的抗体、抗体亚类和/或经工程化的亚类变体时非常重要。人抗体分子对单独人fcγ受体的亲和力和/或亲合力可以使用表面等离子体共振(spr)来确定。在一些实施例中，阻断tnfr2抗体分子对活化fcγ受体结合的亲和力比对抑制性fcγ受体结合的亲和力更高。对活化fcγ受体的亲和力比对抑制性fcγ受体的亲和力更高，包含了与对抑制性fcγ受体的亲和力相比，变体对活化fcγ受体，例如fcγriia、fcγriiia和/或fcγri结合的亲和力更高的含义。

40、在一些实施例中，抗体分子是可以通过抗体分子的fc区与fcγ受体之间的正常相互作用而与fcγ受体结合的igg。

41、在一些实施例中，拮抗性阻断tnfr2抗体分子是人igg1。众所周知，人igg1以对活化人fcγri的高亲和力结合，并且以对人活化性fcγ受体fcγriia、fcγriiia以及对人抑制性fcγriib的更低且相似的亲和力结合。这已经使用例如表面等离振子共振(spr)证明。

42、在一些实施例中，拮抗性阻断tnfr2抗体分子是示出改善了与一种或几种活化性fc受体的结合和/或被工程化为用于改善与一种或几种活化性fcγ受体的结合和/或被工程化为用于改善相对于抑制性fcγ受体与活化性fcγ受体相对结合的igg抗体分子。在一些实施例中，抗tnfr2抗体是经fc工程化的人igg1抗体。此类经工程化的抗体变体的实例包含抗体与fcγriiia的结合选择性地改善的岩藻糖基化抗体，以及通过定向、突变或其它方式、导致与抑制性fcγriib相比，改善与一种或几种活化fcγ受体的结合的氨基酸取代进行工程化的抗体(richards等人,2008“抗体与fcγriia的结合的优化增强了肿瘤细胞的巨噬细胞吞噬(optimization of antibody binding to fcgammariia enhancesmacrophage phagocytosis of tumor cells)”，《分子癌症疗法(mol cancer ther)》7:2517-27；lazar等人,2006“具有增强的效应功能的经工程化的抗体fc变体(engineeredantibody fc variants with enhanced effector function)”,《美国国家科学院院刊》,103:4005-10)。

43、在一些实施例中，被工程化用于改善与活化fcγ受体的结合的人igg抗体可以是在其fc部分中具有两个突变s239d和i332e或三个突变s239d、i332e和a330l和/或g236a突变的人igg抗体。在一些实施例中，被工程化用于改善与活化fcγ受体的结合的人igg抗体可以是岩藻糖基化的人igg抗体。

44、本发明的拮抗性阻断抗体分子的fc区所结合的fcγ受体可以是如上所述的表达免疫效应细胞的fcγ受体。

45、tnfr2特异性抗体分子与靶细胞上的tnfr2表面受体的结合以及fcγr在同一细胞或免疫效应细胞上的紧密共连接可能导致抗体分子所结合的tnfr2阳性靶细胞的耗竭或功能调节。细胞的耗竭在本文中是指通过细胞的物理清除来耗竭、缺失或消除细胞。

46、细胞的耗竭可以通过adcc，即抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或抗体依赖性细胞毒性，和/或adcp，即抗体依赖性细胞吞噬来实现。这意味着当向患者，如人施用如本文所述的抗体分子时，其与在如treg等细胞的表面上表达的tnfr2特异性结合，并且此结合导致细胞耗竭。通常，与低表达细胞相比，高表达细胞更有效地缺失。如实例5、图14中示出的，treg是肿瘤设置中的最高表达细胞。

47、adcc是具有fc受体的效应细胞通过其可以识别并杀死，即耗竭在其表面上表达肿瘤来源的抗原，即在当前情况下，tnfr2的抗体涂覆的靶细胞的免疫机制。adcp是类似的机制，但是其会导致靶细胞通过吞噬而非细胞毒性被杀死–即，耗竭。

48、另外，抗体分子的fc区与fcγ受体的结合的改善也可以改善借助于adcc或adcp通过fc受体依赖性死亡耗竭靶细胞。这对于与活化fcγ受体的结合改善的抗体分子尤其相关。

49、抗体分子对tnfr2阳性细胞具有耗竭作用意指在施用于如人等患者后，此抗体分子与在tnfr2阳性细胞的表面上表达的tnfr2特异性结合,并且此结合导致此类靶细胞的耗竭。

50、耗竭的细胞可以是许多不同细胞，如以上结合靶细胞是什么的讨论所解释的。通常是，具有最高tnfr2表达的细胞将耗竭。也表达tnfr2但不那么高的其它细胞也可能耗竭，但与具有最高tnfr2表达的细胞相比，程度却很小。

51、如以上所提及的，tnfr2在发现于各种癌症患者的肿瘤中的treg上高度表达，并且在此类患者中，本发明的抗体分子将与treg优先结合，并且由此导致treg耗竭。treg对其它免疫细胞(如cd8阳性(cd8+)细胞)的增殖、活化和细胞毒性能力具有抑制作用，并且因此treg的耗竭将至少间接地导致cd8+细胞的增殖、活化和可能的迁移增加以及由此肿瘤内cd8+细胞的数量增加。cd8+t细胞对于免疫介导的肿瘤细胞清除至关重要(mckinney等人,《免疫学当前观点(curr opin immunol)》2016年12月；43:74-80；klebanoff等人,《免疫学综述(immunol rev.)》2006jun；211:214-24；alexander-miller《免疫学研究(immunolres.)》2005；31(1):13-24)。因此，cd8+t细胞的增殖、活化和细胞毒性能力的增加将对癌症患者高度有益并且可能导致根除癌症。

52、cd8+t细胞的增殖、活化和细胞毒性能力的增加还将对治疗由细胞内病原体引起的感染高度有益。来自细胞内病原体的抗原通常存在于mhc i分子上，这在活化cd8+t细胞中是关键的。cd8+t细胞由此识别感染的细胞并且使受感染的细胞裂解，从而破坏病原体。

53、tnfr2特异性抗体分子的结合和tnf-α信号传导的阻断还可能导致细胞表型的功能性调节，例如将促肿瘤骨髓细胞调节为具有杀肿瘤性质的骨髓细胞。

54、在一些实施例中，tnfr2阳性细胞，即靶细胞是cd4阳性(cd4+)细胞，即表达cd4的细胞。

55、在一些实施例中，tnfr2阳性细胞是cd4+和foxp3+两者，即表达cd4和foxp3两者。这些细胞是treg。cd8+t细胞也表达tnfr2，但treg表达的tnfr2的水平显著高于cd8阳性t细胞，如实例5中的图14中示出的。与较低表达cd8+细胞相比，这使treg更易于耗竭。

56、在一些情况下，tnfr2优先在肿瘤微环境中的免疫细胞(肿瘤浸润细胞，tils)上表达。

57、在一些实施例中，treg将是肿瘤微环境中具有最高tnfr2表达，从而导致与tnfr2特异性结合的抗体分子(或抗tnfr2抗体分子)具有treg耗竭作用的细胞。这在以下，例如在实例5中并且结合图13和15进行了更详细的讨论。

58、在一些实施例中，tnfr2阳性细胞将是实体瘤中的treg。此类treg将具有非常高的tnfr2表达，并且因此施用与tnfr2特异性结合的抗体分子将优先导致此类treg的耗竭。

59、为了确定抗体分子是否是如本文所提及的，对tnfr2阳性细胞具有耗竭作用的抗体分子，可以使用pbmc-nog/scid中的体内测试。体内测试是基于pbmc小鼠和nog/scid小鼠的组合用途，这在本文中被称为pbmc-nog/scid模型。nog小鼠和scid小鼠是技术人员已知的(ito m等人,(2002)nod/scid/γcnull小鼠：用于植入人类细胞的优异接受者小鼠模型《血液(blood)》100(9):3175-3182；bosma gc等人；《自然(nature)》1983年2月10日；301(5900):527-30；小鼠中的严重的组合免疫缺陷突变)并且pbmc-nog模型是已知的(cox等人“抗体介导的orai1钙通道的靶向抑制t细胞功能(antibody-mediated targeting of theorai1calcium channel inhibits t cell function)”《公共科学图书馆·综合(plosone.)》2013年12月23日；8(12):e82944；以及等人“人t细胞依赖于功能性钙调神经磷酸酶、肿瘤坏死因子-α和cd80/cd86以在小鼠中扩增和活化(human t cells dependon functional calcineurin,tumor necrosis factor-αand cd80/cd86 for expansionand activation in mice)”《临床与实验免疫学(clin exp immunol.)》2013年5月；172(2):300-10)。pbmc-nog/scid模型中的体内测试包括以下连续的九个步骤：

60、1)将人pbmc(外周血单核细胞)分离、洗涤并重悬于无菌pbs中。在一些实施例中，以75×106个细胞/ml将pbmc重悬于pbs中。

61、2)向nog小鼠i.v.(静脉内)注射适当量(如200μl)的来自步骤1)的细胞悬浮液。如果注射200μl，则这对应于15×106个细胞/小鼠。

62、3)在注射之后的合适时间，如2周，分离来自nog小鼠的脾脏并且使其成为单细胞悬浮液。任选地，提取来自单细胞悬浮液的小样品，以通过facs确定tnfr2在人t细胞上的表达，以便确认tnfr2表达。

63、4)将来自步骤3)的细胞悬浮液重悬于无菌pbs中。在一些实施例中，以50×106个细胞/ml将细胞悬浮液重悬于无菌pbs中。如果步骤3中包含了任选tnfr2表达的确定，则在步骤4中重悬细胞悬浮液的其余部分。

64、5)向scid小鼠i.p.(腹膜内)注射适当的量(如200μl)的来自步骤4的悬浮液。如果注射200μl，则这对应于10×106个细胞/小鼠。

65、6)在步骤5)中的注射之后的合适时间，如1小时，用适当量(如10mg/kg)的待测试的抗体分子、阳性对照抗体(例如，已知耗竭treg的抗cd25抗体)或同种型对照单克隆抗体对scid小鼠进行治疗。

66、7)在步骤6)中的处理之后的合适时间，如24小时，收集经治疗的scid小鼠的腹膜液。

67、8)使用以下标志物通过facs标识人t细胞亚群并对其进行量化：cd45、cd4、cd8、cd25和/或cd127。公认的是，人treg在人pbmc群中可以被区分为cd4+cd25+cd127low/-。

68、9)将来自对来自用测试的抗体分子治疗的小鼠的t细胞亚群的标识和量化的结果与来自对来自用阳性对照抗体治疗的小鼠的t细胞亚群的标识和量化的结果以及来自对来自用同种型对照单克隆抗体治疗的小鼠的t细胞亚群的标识和量化的结果进行比较。来自用待测试的抗体分子治疗的小鼠的腹膜液中的treg的数量比来自用同种型对照治疗的小鼠的腹膜液中的treg的数量低证明了抗体分子对tnfr2阳性treg具有耗竭作用。

69、此测定在以下实例5中结合图15进行了更详细的展示。

70、如以上所提及的，其它细胞也可以表达tnfr2，如癌细胞。在一些实施例中，抗体分子与在癌细胞上表达的tnfr2优先结合，并且所述结合然后直接导致癌细胞的耗竭。

71、抗体是免疫学和分子生物学领域的技术人员众所周知的。通常，抗体包括两条重(h)链和两条轻(l)链。在此，有时将此完整抗体分子称为全尺寸(full-size)或全长(full-length)抗体。抗体的重链包括一个可变结构域(vh)和三个恒定结构域(ch1、ch2和ch3)，并且抗体的分子轻链包括一个可变结构域(vl)和一个恒定结构域(cl)。可变结构域(有时统称为fv区)与抗体的靶标或抗原结合。每个可变结构域包括三个环，所述环被称为互补决定区(cdr)，其负责靶标结合。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，而是表现出各种效应功能。根据抗体或免疫球蛋白的重链恒定区的氨基酸序列，所述抗体或免疫球蛋白可以被分配到不同类别。存在免疫球蛋白的五个主要类别：iga、igd、ige、igg和igm，并且在人类中，这些类别中的几个类别被进一步划分为亚类(同种型)，例如，igg1、igg2、igg3和igg4、iga1和iga2。

72、抗体的另一部分是fc区(另外被称为片段可结晶结构域)，其包括所述抗体的重链中的每条重链的恒定结构域中的两个恒定结构域。如上所提及的，fc区负责抗体与fc受体之间的相互作用。

73、如本文所使用的术语抗体分子涵盖全长或全尺寸抗体以及全长抗体的功能片段和此类抗体分子的衍生物。

74、全尺寸抗体的功能片段具有与对应全尺寸抗体相同的抗原结合特性并且包含与对应全尺寸抗体相同的可变结构域(即，vh和vl序列)和/或相同的cdr序列。功能片段不总是含有对应全长抗体的所有六个cdr。应当理解的是，含有三个或更少个cdr区(在一些情况下，甚至仅单个cdr或其一部分)的分子能够保留一个或多个cdr所衍生的抗体的抗原结合活性。例如，在gao等人,1994,《生物化学杂志》,269:32389-93中，描述了整个vl链(包含所有三个cdr)对其底物具有高亲和力。

75、含有两个cdr区的分子描述于例如，vaughan和sollazzo 2001,《组合化学与高通量筛选(combinatorial chemistry&high throughput screening)》,4:417-430中。在第418页(右栏—3“设计策略(our strategy for design)”)中，描述了仅包含散布在框架区内的h1和h2 cdr高变区的微抗体。所述微抗体被描述为能够与靶标结合。vaughan和sollazzo引用了以下pessi等人,1993,《自然》,362:367-9和bianchi等人,1994,《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》,236:649-59，并且所述文献更详细地描述了h1和h2微抗体和其性质。在qiu等人,2007,《自然生物技术(nature biotechnology)》,25:921-9中，证明了由两个连接的cdr组成的分子能够结合抗原。quiocho 1993,《自然》,362:293-4提供了“微抗体”技术的总结。ladner 2007,《自然生物技术》,25:875-7指出，含有两个cdr的分子能够保留抗原结合活性。

76、含有单个cdr区的抗体分子描述于例如，laune等人,1997,《生物化学杂志》,272:30937-44中，其中证明了衍生自cdr的一系列六肽显示出抗原结合活性，并且注意到完整的单个cdr的合成肽显示出强结合活性。在monnet等人,1999,《生物化学杂志》,274:3789-96中，示出了一系列12聚体肽和相关框架区具有抗原结合活性，并且指出cdr3样肽单独能够结合抗原。在heap等人,2005,《普通病毒学杂志(j.gen.virol.)》,86:1791-1800中，报道了“微抗体”(含有单个cdr的分子)能够结合抗原，并且示出来自抗hiv抗体的环状肽具有抗原结合活性和功能。在nicaise等人,2004,《蛋白质科学(protein science)》,13:1882-91中，示出了单个cdr可以赋予抗原结合活性和对其溶菌酶抗原的亲和力。

77、因此，具有五个、四个、三个或更少的cdr的抗体分子能够保留其所衍生的全长抗体的抗原结合性质。

78、抗体分子也可以是全长抗体的衍生物或此抗体的片段，条件是片段的此衍生物保留了fcγ受体结合能力。当使用衍生物时，所述衍生物应当具有与对应全长抗体相同的抗原结合特性，在某种意义上所述衍生物与靶标上的和全长抗体相同的表位结合。

79、因此，如本文所使用的术语“抗体分子”包含所有类型的抗体分子以及其功能片段和其衍生物，包含：单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、人抗体、人来源抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、抗体重链、抗体重链的同二聚体、抗体重链的异二聚体以及抗体轻链的异二聚体。

80、进一步地，如本文所使用的术语“抗体分子”包含所有类别的抗体分子和功能片段，包含：igg、igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igm、igd和ige，除非另有说明。

81、在一些实施例中，抗体分子是人抗体分子、人源化抗体分子或人来源的抗体分子。在一些此类实施例中，抗体分子是igg抗体。在一些实施例中，抗体分子具有以最优方式连接活化fc受体的同种型。在一些实施例中，抗体分子是igg1抗体。

82、技术人员应当理解，小鼠igg2a和人igg1与活化性fcγ受体连接，并且分享通过由例如adcp和adcc对具有活化性fcγ受体的免疫细胞进行的活化来激活靶细胞的缺失的能力。在一些实施例中，抗tnfr2抗体是鼠或人源化鼠igg2a抗体。

83、在一些实施例中，特异性结合tnfr2的抗体分子是人igg2抗体分子。

84、在一些实施例中，抗tnfr2抗体是与人tnfr2具有交叉反应性的鼠抗体。

85、如上所概述的，本发明涵盖不同类型和形式的抗体分子，并且所述不同类型和形式的抗体分子将是免疫学领域的技术人员已知的。众所周知的是，用于治疗目的的抗体通常被修饰抗体分子的性质的另外的组分修饰。

86、因此，包含了本文所述的抗体分子，或如本文所述的使用抗体分子(例如，单克隆抗体分子和/或多克隆抗体分子和/或双特异性抗体分子)包括可检测部分和/或细胞毒性部分。

87、“可检测部分”包含来自包括以下的组的一种或多种：酶；放射性原子；荧光部分；化学发光部分；生物发光部分。可检测部分允许抗体分子在体外和/或体内和/或离体可视化。

88、“细胞毒性部分”包含放射性部分和/或酶，例如其中酶是胱天蛋白酶和/或毒素，例如其中毒素是细菌毒素或毒液；其中细胞毒性部分能够诱导细胞裂解。

89、进一步包含了抗体分子可以呈分离的形式和/或经纯化的形式，和/或可以是聚乙二醇化的。聚乙二醇化是向分子，如抗体分子或衍生物，添加聚乙二醇聚合物以修饰其行为，例如以通过增加其水动力学尺寸来延长其半衰期，从而防止肾清除的方法。

90、如上所讨论的，抗体的cdr与抗体靶标结合。向本文所描述的每个cdr分配氨基酸符合根据以下的定义：kabat ea等人,1991,“免疫学上所关注的蛋白质的序列(sequencesof proteins of immunological interest)”第五版,nih出版号：91-3242,第xv-xvii页。

91、如技术人员将了解的，还存在用于向每个cdr分配氨基酸的其它方法。例如，国际免疫遗传学信息系统(international immunogenetics information system)(imgt(r))(http://www.imgt.org/，以及lefranc和lefranc“免疫球蛋白概况(the immunoglobulinfactsbook)”,由学术出版社(academic press)出版,2001)。

92、在一些实施例中，特异性结合tnfr2的抗体分子是人抗体。

93、在一些实施例中，特异性结合tnfr2的抗体分子是人来源的抗体，即已经如本文所描述的进行修饰的最初人抗体。

94、在一些实施例中，特异性结合tnfr2的抗体分子是人源化抗体，即已经被修饰以增加其与人抗体的相似性的最初非人抗体。人源化抗体可以具有例如鼠抗体或lama抗体。

95、在一些实施例中，抗tnfr2抗体是单克隆抗体。

96、在一些实施例中，抗tnfr2抗体是多克隆抗体。

97、在一些实施例中，特异性结合tnfr2的抗体分子包括以下表1中列出的vh-cdr1序列之一。

98、在一些实施例中，特异性结合tnfr2的抗体分子包括以下表1中列出的vh-cdr2序列之一。

99、在一些实施例中，特异性结合tnfr2的抗体分子包括以下表1中列出的vh-cdr3序列之一。

100、在一些实施例中，特异性结合tnfr2的抗体分子包括以下表1中列出的vl-cdr1序列之一。

101、在一些实施例中，特异性结合tnfr2的抗体分子包括以下表1中列出的vl-cdr2序列之一。

102、在一些实施例中，特异性结合tnfr2的抗体分子包括以下表1中列出的vl-cdr3序列之一。

103、在一些实施例中，抗tnfr2抗体分子是：包括具有以下的6个cdr的抗体分子：seq.id.no:1、2、3、4、5和6；或包括具有以下的6个cdr的抗体分子：seq.id.no:9、10、11、12、13和14；或包括具有以下的6个cdr的抗体分子：seq.id.no:17、18、19、20、21和22。

104、在一些实施例中，抗tnfr2抗体分子是：包括具有以下的6个cdr的抗体分子：seq.id.no:1、2、3、4、5和6。

105、在一些实施例中，抗tnfr2抗体分子是选自由包括vh的抗体分子组成的组的抗体分子，所述vh选自由以下组成的组：seq.id.no:7、15和23。

106、在一些实施例中，抗tnfr2抗体分子是选自由包括vl的抗体分子组成的组的抗体分子，所述vl选自由以下组成的组：seq.id.no:8、16和24。

107、在一些实施例中，抗tnfr2抗体分子是包括具有seq.id.no:7的vh的抗体分子。

108、在一些实施例中，抗tnfr2抗体分子是包括具有seq.id.no:8的vl的抗体分子。

109、在一些实施例中，抗tnfr2抗体分子包括具有seq.id.no:7的vh和具有seq.id.no:8的vh。

110、在一些实施例中，抗tnfr2抗体分子包括具有seq.id.no:217的ch。

111、在一些实施例中，抗tnfr2抗体分子包括具有seq.id.no:218的cl。

112、在一些实施例中，抗tnfr2抗体分子包括具有seq.id.no:7的vh、具有seq.id.no:8的vh、具有seq.id.no:217的ch和具有seq.id.no:218的cl。

113、表1：根据本发明的拮抗性tnfr2阻断抗体分子的特定序列(在vh和vl序列中，cdr序列以粗体标记)

114、

115、

116、表2：非拮抗性的并且在本文中用于比较的tnfr2阻断抗体分子的特定序列(在vh和vl序列中，cdr序列以粗体标记)

117、

118、

119、

120、

121、为了确定或证明本发明的抗体分子的特征，将其与不阻断tnf-α配体与tnfr2结合的抗体分子进行了比较。此类抗体示出在表3中。

122、表3：本文提及的作为参考抗体的非阻断tnfr2抗体分子的特定序列(在vh和vl序列中，cdr序列以粗体标记)

123、

124、

125、

126、

127、以上表1、2和3中的序列均为人类起源的并且衍生自库，如实例1中详细解释的。

128、在一些实施例中，特异性结合本文所述的tnfr2的抗体分子还可以包括以下表4中列出的恒定区(ch和/或cl)中的一个或两个。

129、表4：

130、

131、

132、以上表4中的第一ch(seq.id.no:217)和第一cl(seq.id.no:218)序列为人类起源。表4中的第二ch(seq.id.no:219)和第三ch(seq.id.no:220)均来自鼠igg2a，其区别在于第三ch序列(seq.id.no:220)含有n297a突变。第二cl序列(seq.id.no:221)来自鼠λ轻链恒定区。这些鼠序列在实例中用于替代抗体。

133、在一些实施例中，抗体分子结合人tnfr2(htnfr2)。

134、在一些实施例中，有利的是，抗体分子与htnfr2和食蟹猴tnfr2(cmtnfr2或cynotnfr2)结合。与在恒河猴，也被称为食蟹猕猴或长尾猕猴体内的细胞上表达的tnfr2的交叉反应可能是有利的，因为这使得能够在不使用替代抗体的情况下，在特别关注耐受性的情况下进行抗体分子的动物测试。

135、在一些实施例中，需要的是使用替代抗体测试小鼠体内的相关体内模型中的抗体分子的功能活性。为了确保人体内的抗体分子的作用与小鼠体内的替代抗体的体内结果之间的可比性，必要的是选择具有与人抗体分子相同的体外特性的功能等效的替代抗体。

136、在一些实施例中，抗体分子不与包括序列kcspg或由序列kcspg组成的tnfr2的表位特异性结合。

137、在一些实施例中，本发明或根据本发明使用的抗体分子是能够与本文提供的特异性抗体竞争，例如能够与包括以下的抗体分子竞争以用于与tnfr2结合的抗体分子：选自由seq.id.no:7、15和23组成的组的vh；和/或选自由seq.id.no:8、16和24组成的组的vl。

138、“能够竞争”意指竞争性抗体能够至少部分地抑制或另外干扰如本文定义的抗体分子与特异性靶标tnfr2的结合。

139、例如，此竞争性抗体分子能够将本文所述的拮抗性阻断抗体分子的结合抑制至少约10％；例如至少约20％、或至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少100％和/或将本文所述的抗体防止或减少tnfr2与特定靶配体tnf-α的结合的能力抑制至少约10％；例如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％。

140、竞争性结合可以通过本领域的技术人员众所周知的方法来确定，如酶联免疫吸附测定(elisa)。

141、可以使用elisa测定来评价表位修饰或阻断抗体。适用于标识竞争性抗体的另外的方法公开于《抗体：实验室手册(antibodies:a laboratory manual)》,harlow和lane中，所述文献通过引用并入本文(例如，参见第567页到第569页、第574页到第576页、第583页以及第590到第612页,1988,冷泉港实验室(cshl),纽约(ny),isbn 0-87969-314-2)。

142、在一些实施例中，所关注的是不使用抗体分子自身，而是使用编码此抗体分子的核苷酸序列。因此，本发明涵盖编码以上拮抗性阻断tnfr-2抗体分子的核苷酸序列。

143、以上所述的拮抗性阻断抗体分子和核苷酸序列可以用于医学中，并且然后此类抗体分子和/或核苷酸序列可以包含在药物组合物中，如以下进一步讨论的。

144、以上所述的拮抗性阻断抗体分子、核苷酸序列和/或药物组合物可以用于治疗癌症，如下文进一步讨论的。

145、以上所述的拮抗性阻断抗体分子、核苷酸序列和/或药物组合物可以用于治疗由细胞内病原体引起的感染，如下文进一步讨论的。

146、以上所述的拮抗性阻断抗体分子和/或核苷酸序列可以用于制造用于治疗癌症的药物组合物。

147、以上所述的拮抗性阻断抗体分子和/或核苷酸序列可以用于制造用于治疗由细胞内病原体引起的感染的药物组合物。

148、以上所述的拮抗性阻断抗体分子和/或药物组合物可以在用于治疗患者的癌症的方法中使用，在所述方法中向所述患者施用治疗有效量的抗体分子或药物组合物。

149、以上所述的拮抗性阻断抗体分子和/或药物组合物可以在用于治疗患者的由细胞内病原体引起的感染的方法中使用，在所述方法中向所述患者施用治疗有效量的抗体分子或药物组合物。

150、在涉及治疗癌症的一些实施例中，所述癌症是实体癌或白血病癌。实体瘤是通常不含有囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性的(不是癌症)或恶性的(癌症)。恶性实体瘤在本文中被称为实体癌。不同类型的实体瘤针对形成其的细胞的类型而命名。实体瘤或癌症的实例是肉瘤、癌和淋巴瘤。

151、实体癌的更具体实例是肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、甲状腺癌、脑癌、中枢神经系统癌、黑素瘤、神经母细胞瘤、威尔姆斯瘤(wilms tumor)、横纹肌肉瘤、视网膜母细胞瘤、头颈癌、胃癌、淋巴瘤和骨癌。

152、白血病癌症的更具体的实例是急性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓增殖性疾病、急性非淋巴细胞性白血病、b细胞急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、t细胞急性淋巴细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin lymphoma)和慢性淋巴细胞增殖性疾病。

153、在涉及治疗由细胞内病原体，如病毒或细菌引起的感染的一些实施例中，细胞内病原体的具体实例是嗜肺军团菌(legionella pneumophila)、立克次氏菌(r.rickettsia)、结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)、单核细胞增多性李斯特氏菌(listeria monocyotogenes)、沙门氏菌(salmonella spp)、侵袭性大肠杆菌(invasive escherichia coli)、奈瑟菌属(neisseria spp)、布鲁氏菌属(brucella spp)、志贺氏菌属(shigella spp)、流感病毒、疱疹病毒、肝炎病毒、柯萨基病毒(coxsackievirus)、艾普斯登-巴尔病毒(epstein-barr virus)或鼻病毒。

154、在涉及治疗癌症的一些实施例中，上述拮抗性阻断抗体分子可以和与检查点抑制剂特异性结合的抗体分子组合使用。可替代地，以上讨论的编码阻断tnfr2抗体分子的核苷酸序列可以和与检查点抑制剂或共刺激性激动性抗体特异性结合的抗体分子组合使用。检查点抑制剂的抗体包含靶向ctla4、pd1、pd-l1、vista、tigit、cd200、cd200r、btla、lag3、tim3、b7-h3、b7-h4、b7-h7的抗体。共刺激性激动性抗体的实例是靶向ox40、41bb、ox40l、41bbl、gitr、icos、dr3、dr4、dr5、cd40、cd27、rank、hvem、light和b7-h6的抗体。可替代地，以上讨论的拮抗性阻断tnfr2抗体分子可以和编码与检查点抑制剂或共刺激性激动剂特异性结合的抗体分子的核苷酸序列组合使用。可替代地，以上讨论的编码阻断tnfr2抗体分子的核苷酸序列可以和编码与检查点抑制剂或共刺激性激动剂特异性结合的抗体分子的核苷酸序列组合使用。在一些实施例中，与检查点抑制剂特异性结合的抗体分子是抗pd-1抗体。pd-1(或pd1)抗体被视为阻断主要cd8+t细胞中的通过pd-l1介导的抑制性信号；并且由此允许增加t细胞介导的抗肿瘤反应。耗竭treg的拮抗性tnfr2抗体将通过单独机制起作用，以增加抗肿瘤反应。因此这些治疗可以彼此协同。这对于其它检查点抑制剂和激动性共刺激性抗体也是如此。

155、另外，以上讨论的拮抗性阻断tnfr2抗体分子可以与其它抗癌治疗组合使用，如化学疗法(例如但不限于多柔比星(doxorubicin)、卡铂、环磷酰胺、太平洋紫杉醇、吉西他滨(gemcitabine)、5-氟尿嘧啶、多西他赛(docetaxel)、长春新碱(vincristine)、米托蒽醌(mitoxantrone)、密吐霉素(mutamycin)、表柔比星(epirubicin)和甲氨蝶呤(methotrexate))、小分子酪氨酸激酶或丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂(例如但不限于依鲁替尼(ibrutinib)、伊马替尼(imatinib)、舒尼替尼(suntinib)、瑞格拉非尼(regorafenib)、索拉非尼(sorafenib)、达沙替尼(dasatinib)、厄洛替尼(erlotinib)、凡德他尼(vandetanib)、米哚妥林(midostaurin)、维莫非尼(vemurafenib)、达拉菲尼(dabrafenib)、帕博西尼(palbociclib)、瑞博西尼(ribociclib)、曲美替尼(trametinib)或艾乐替尼(alectinib))、靶向生长因子受体的抑制剂(例如但不限于靶向egfr/her1/erbb1、egfr2/her2/erbb2、egfr3/her3/erbb3、vegfr、pdgfr hgfr、ret、胰岛素样生长因子受体igfr、fgfr的药物)、抗血管生成剂(例如但不限于贝伐单抗(bevacizumab)、依维莫司(everolimus)、来那度胺(lenalidomide)、沙利度胺(thalidomide)、齐夫-阿非西普(ziv-aflibercept))或辐射。典型地，以上提及的抗癌药物均引起癌细胞死亡，这将导致新抗原暴露和发炎。在新抗原暴露并且肿瘤中存在炎性细胞涌入时，可能发生抗癌药物的协同作用，并且添加可以耗竭treg并且由此可以增强免疫系统的拮抗性配体阻断tnfr2抗体甚至更进一步。

156、医学领域的技术人员将理解，药物可以用不同添加剂来修饰，例如以改变身体吸收药物的速率；并且药物可以以不同形式修饰，例如以允许到身体的特定施用途径。

157、因此，包含了本文所述的拮抗性阻断抗体分子、核苷酸序列、质粒、病毒和/或细胞可以与药学上可接受的赋形剂、载体、稀释剂、媒剂和/或佐剂一起组合成药物组合物。在此上下文中，术语药物组合物与术语药物制剂、药物调配物、治疗组合物、治疗制剂、治疗调配物和治疗实体可互换使用。

158、本文所述的药物组合物可以包括以下，或在一些实施例中可以由以下组成：抗体分子、核苷酸序列、质粒、病毒或细胞。

159、在一些实施例中，本文所述的药物组合物可以由质粒组成或包括质粒，所述质粒包括编码上述抗体分子或包括上述核苷酸序列的核苷酸序列。

160、在一些实施例中，药物组合物可以包括编码整合在细胞或病毒基因组中或病毒体中的本文所述的抗体分子的部分或完整抗体分子的核苷酸序列。然后，药物组合物可以包括作为本发明的抗体的递送媒剂的细胞或病毒(或编码本发明的抗体的核苷酸序列的递送媒剂)。例如，在实施例中，病毒可以呈治疗性溶瘤病毒的形式，所述治疗性溶瘤病毒包括编码本文所述的抗体分子中的至少一个抗体分子的核苷酸序列。在一些实施例中，此溶瘤病毒包括编码全长人igg抗体的核苷酸序列。

161、在一些实施例中，本发明涉及包括本发明的核苷酸序列或本发明的质粒的病毒。优选地，病毒是溶瘤病毒，如治疗性溶瘤病毒。此类病毒是医学和病毒学领域的技术人员已知的。

162、在一些实施例中，此溶瘤病毒包括编氨基酸序列的与以上表1中列示的序列具有至少80％同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，此溶瘤病毒包括与以上表1中列示的序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，此溶瘤病毒包括与以上表1中列示的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，此溶瘤病毒包括与以上表1中列示的序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。

163、例如，编码抗体001-h10的核苷酸序列可以如表5中呈现的。

164、表5：编码抗体001-h10的核苷酸序列的实例–表中带下划线的序列的一部分分别编码001-h10的vh和vl序列

165、

166、

167、一些溶瘤病毒具有容纳足够大的dna插入以适应全长人抗体序列整合的能力。减弱型痘苗病毒和单纯疱疹病毒是其基因组大到足以允许整合全长igg抗体序列的治疗性溶瘤病毒的实例(chan等人,2014,“溶瘤痘病毒(oncolytic poxviruses)”,《病毒学年度评论(annu rev virol)》1:119-41；bommareddy等人,2018,“在组合癌症免疫疗法中整合溶瘤病毒(integrating oncolytic viruses in combination cancer immunotherapy)”,《自然综述免疫学(nat rev immunol)》18:498-513)。已经将全长igg抗体成功整合成溶瘤牛痘病毒，这引起在病毒易感性宿主细胞，例如癌细胞感染时表达和细胞外释放(产生)全长igg抗体(kleinpeter等人,2016,“在抗体、fab和scfv的溶瘤牛痘病毒中针对程序性细胞死亡-1(pd-1)的载体化允许其肿瘤内递送以及改善肿瘤生长抑制(vectorization in anoncolytic vaccinia virus of an antibody,a fab and a scfv against programmedcell death-1(pd-1)allows their intratumoral delivery and an improved tumor-growth inhibition)”《肿瘤免疫学(oncoimmunology)》5:e1220467)。腺病毒也可以被工程为编码在细胞感染时功能性地产生并且分泌的全长igg抗体(marinon.等人,2017“用于治疗性转基因的局部肿瘤内表达的多功能溶瘤病毒平台的开发(development of aversatile oncolytic virus platform for local intra-tumoural expression oftherapeutic transgenes)”《公共科学图书馆·综合》12:e0177810)。

168、本发明还涵盖包括病毒，如上文所讨论的溶瘤病毒以及药学上可接受的稀释剂、媒剂和/或佐剂的药物组合物。

169、本发明还包括其它治疗方式或“形状”的药物，如抗体药物缀合物、输注蛋白质等，以及包括此类治疗方式的药物组合物。

170、本文所述的抗体分子、核苷酸序列、质粒、病毒、细胞和/或药物组合物可以适合于肠胃外施用，其包含水性和/或非水性无菌注射溶液，所述水性和/或非水性无菌注射溶液可以含有抗氧化剂和/或缓冲剂和/或抑菌剂和/或使调配物与预期接受者的血液等渗的溶质；和/或水性和/或非水性无菌悬浮液，所述水性和/或非水性无菌悬浮液可以包含悬浮剂和/或增稠剂。本文所述的抗体分子、核苷酸序列、质粒、细胞和/或药物组合物可以在单位剂量或多剂量容器(例如密封安瓿和小瓶)中呈现并且可以在冷冻干燥(即冻干)条件下储存，仅需要在立即使用之前添加无菌液体载体，例如注射用水。

171、可以由前述种类的无菌粉末和/或颗粒和/或片剂制备临时注射溶液和悬浮液。

172、对于人类患者的肠胃外施用，抗tnfr2抗体分子的日常剂量水平通常将为1mg/kg患者体重到20mg/kg，或者在一些情况下以单个剂量或分开的剂量施用甚至高达100mg/kg。在特殊情况下，例如在结合长期施用的情况下，可以使用较低剂量。在任何情况下，医生将确定最适合于任何个体患者的实际剂量，并且所述实际剂量将随着特定患者的年龄、体重和反应而变化。上述剂量是一般情况的示例。当然，可以存在个别情况，其中更高或更低的剂量范围是理所当然的，并且此剂量处于本发明的范围内。

173、典型地，本文所述的包括抗体分子的药物组合物(或药物)将含有浓度介于大约2mg/ml与150mg/ml之间或介于大约2mg/ml与200mg/ml之间的抗tnfr2抗体分子。

174、通常，在人类中，本文所述的抗体分子、核苷酸序列、质粒、病毒、细胞和/或药物组合物的口服或肠胃外施用是优选途径，是最方便的。对于兽医用途，本文所述的抗体分子、核苷酸序列、质粒、病毒、细胞和/或药物组合物根据正常兽医实践，以适当可接受的调配物形式施用，并且兽医将确定最适合于特定动物的给药方案和施用途径。因此，本发明提供了包括一定量的对于治疗各种病状有效的本发明的抗体分子、核苷酸序列、质粒、病毒和/或细胞的药物调配物(如上文和下文进一步描述的)。优选地，本文所述的抗体分子、核苷酸序列、质粒、病毒、细胞和/或药物组合物适用于通过选自包括以下的组的途径递送：静脉内(iv或i.v.)；肌肉内(im或i.m.)；皮下(sc或s.c.)或肿瘤内。

175、本发明还包含包括本发明的靶结合分子或部分的药学上可接受的酸或碱加成盐的本文所述的抗体分子、核苷酸序列、质粒、病毒、细胞和/或药物组合物。用于制备可用于本发明的上述碱化合物的药学上可接受的酸加成盐的酸是形成无毒酸加成盐的酸，即含有药理学上可接受的阴离子的盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸性磷酸盐、乙酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、酸性柠檬酸盐、酒石酸盐、酒石酸氢盐、琥珀酸盐、马来酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、蔗糖酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐[即，1,1'-亚甲基-双-(2-羟基-3萘甲酸酯)]盐等。也可以使用药学上可接受的碱加成盐来产生药学上可接受的盐形式的根据本发明的药剂。可以用作试剂以制备在性质上为酸性的本发明药剂的药学上可接受的碱盐的化学碱是与此类化合物形成无毒碱盐的那些。此类无毒碱盐包含但不限于：衍生自此类药理学上可接受的阳离子的碱盐，如碱金属阳离子(例如，钾和钠)和碱土金属阳离子(例如，钙和镁)的那些；铵或水溶性胺加成盐，如n-甲基葡糖胺-(葡甲胺)；以及低级链烷醇铵和药学上可接受的有机胺的其它碱盐等。本文所述的抗体分子、核苷酸序列、质粒、病毒和/或细胞可以冻干以用于在使用前储存并在合适的载体中重组。可以采用任何合适的冻干方法(例如，喷雾干燥、滤饼干燥(cake drying))和/或重组技术。本领域的技术人员将理解，冻干和重组可能导致不同程度的抗体活性损失(例如，利用常规免疫球蛋白，igm抗体的活性损失往往比igg抗体更大)，并且可能必须向上调整使用水平以进行补偿。在一个实施例中，当再水化时，冻干的(冷冻干燥的)多肽结合部分损失的活性(在冻干之前)不超过约20％、或不超过约25％、或不超过约30％、或不超过约35％、或不超过约40％、或不超过约45％、或不超过约50％。

176、本文所述的抗tnfr2抗体分子、核苷酸序列和药物组合物可以用于治疗受试者或患者的癌症。在本文中，术语受试者和患者可互换使用。

177、如本文所用的术语“患者”(或受试者)是指已经被诊断为患有具体疾病的动物，包含人。

178、在一些实施例中，患者(或受试者)是已被诊断为患有癌症和/或表现出癌症的症状的动物，包含人。

179、在一些实施例中，患者(或受试者)是已被诊断为患有由细胞内病原体引起的感染和/或表现出由细胞内病原体引起的感染的症状的动物，包含人。

180、在一些实施例中，患者(或受试者)是患病组织中具有高tnfr2表达的患者。在此上下文中，高表达意指与对应健康组织相比更高水平的tnfr2表达。通常，用于此比较的健康组织是从一个或几个健康个体的健康组织中收集的参考组织(或标准参考)。表达的水平可以通过标准技术测量，如免疫组织化学(ihc)、荧光激活细胞分选(facs)或mrna表达测量。

181、包含了患者可以是哺乳动物或非哺乳动物。优选地，哺乳动物患者是人、马、牛、羊、猪、骆驼、狗或猫。最优选地，哺乳动物患者是人。

182、“表现出”癌症的症状包含了，患者展现出癌症症状和/或癌症诊断标志物和/或所述癌症症状和/或癌症诊断标志物可以被测量和/或评估和/或量化。

183、对于医学技术人员容易理解的是，癌症症状和癌症诊断标志物将是什么以及如何测量和/或评估和/或量化癌症症状的严重度是否降低或增加、或癌症诊断标志物是否减少或增加；以及如何可以使用那些癌症症状和/或癌症诊断标志物来形成癌症的预后。

184、癌症治疗通常以一系列治疗的治疗形式施用，也就是说，治疗剂在一段时间内施用。一系列治疗的时间的长度将取决于许多因素，所述许多因素可以包含所施用的治疗剂的类型、所治疗的癌症的类型、所治疗的癌症的严重度以及患者的年龄和健康状况等其它原因。

185、“治疗期间”包含了，患者当前正在接受一系列治程和/或正在接受治疗剂、和/或正在接受一系列治疗剂。

186、在一些实施例中，根据本发明的待治疗的癌症是实体瘤。

187、上述癌症中的每一种癌症都是众所周知的，并且如用于治疗那些癌症的治疗剂一样对症状和癌症诊断标志物进行了很好的描述。因此，症状、癌症诊断标志物和用于治疗以上提及的癌症类型的治疗剂将是医学技术人员已知的。

188、对大量癌症的诊断、预后和进展的临床定义依赖于被称为分期的某些分类。那些分期系统用于核对许多不同癌症诊断标志物和癌症症状，以提供对癌症的诊断和/或预后和/或进展的概述。肿瘤学的技术人员将理解如何使用分期系统评估癌症的诊断和/或预后和/或进展，以及应该使用哪些癌症诊断标志物和癌症症状来进行评估。

189、“癌症分期”包含：rai分期，所述rai分期包含0期、i期、ii期、iii期和iv期；和/或binet分期，所述binet分期包含a期、b期和c期；和/或安娜堡分期(ann arbour staging)，所述安娜堡分期包含i期、ii期、iii期和iv期。

190、已知的是，癌症可以引起细胞形态的异常。这些异常通常可再现地发生在某些癌症中，这意味着在癌症的诊断或预后中可以使用检查形态的这些变化(另外被称为组织学检查)。用于使样品可视化以检查细胞形态并且用于制备用于可视化的样品的技术是本领域众所周知的；例如，光学显微镜或共聚焦显微镜。

191、“组织学检查”包含：存在小型成熟淋巴细胞；和/或存在具有狭窄细胞质边界的小型成熟淋巴细胞；存在具有缺乏可辨别的核仁的致密核的小型成熟淋巴细胞；和/或存在具有狭窄细胞质边界并且具有缺乏可辨别的核仁的致密核的小型成熟淋巴细胞；和/或存在非典型细胞和/或裂解的细胞和/或幼淋巴细胞。

192、众所周知，癌症是细胞dna突变的结果，所述突变可能导致细胞避免细胞死亡或不可控制地增殖。因此，检查这些突变(也被称为细胞遗传学检查)可能是用于评估癌症的诊断和/或预后的有用工具。这一点的实例是染色体位置13q14.1的缺失，这是慢性淋巴细胞性白血病的特性。用于检查细胞的突变的技术是本领域中众所周知的；例如，荧光原位杂交(fish)。

193、“细胞遗传学检查”包含检查细胞以及具体地染色体中的dna。细胞遗传学检查可以用于标识dna的变化，所述变化可能与难治性癌症和/或复发性癌症的存在相关联。此类变化可以包含：染色体13的长臂中的缺失；和/或染色体位置13q14.1的缺失；和/或染色体12的三体性；和/或染色体12的长臂中的缺失；和/或染色体11的长臂中的缺失；和/或11q的缺失；和/或染色体6的长臂中的缺失；和/或6q的缺失；和/或染色体17的短臂中的缺失；和/或17p缺失；和/或t(11:14)易位；和/或(q13:q32)易位；和/或抗原基因受体重排；和/或bcl2重排；和/或bcl6重排；和/或t(14:18)易位；和/或t(11:14)易位；和/或(q13:q32)易位；和/或(3:v)易位；和/或(8:14)易位；和/或(8:v)易位；和/或t(11:14)和(q13:q32)易位。

194、已知的是，患有癌症的患者表现出某些身体症状，所述身体症状通常是由于癌症对身体的负担引起的。那些症状通常再发生在同一癌症中，并且因此可以作为疾病的诊断和/或预后和/或进展的特性。医学领域的技术人员将理解哪些身体症状与哪些癌症相关联，以及评估那些身体系统如何与疾病的诊断和/或预后和/或进展相关。“身体症状”包含肝肿大和/或脾肿大。