一种纯化重组带状疱疹蛋白的方法与流程

本发明属于蛋白纯化，尤指一种纯化重组带状疱疹蛋白的方法。

背景技术：

1、带状疱疹由潜伏在神经元内的水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus，vzv)重新激活，表现为成簇集型水泡，通常出现在老年人、儿童等免疫力低下或患有慢性皮肤病的人群。vzv由双链dna、核衣壳及其表面包膜附着的糖蛋白组成，其中糖蛋白在侵染细胞并发挥免疫原性的过程中起到重要作用。vzv病理学的一个标志是在皮损中形成多核细胞，这种多核细胞是由糖蛋白gb、gh和gl介导的细胞间融合构成的。糖蛋白e(ge)是最丰富的一类蛋白，具有高度免疫原性，也是研究重组带状疱疹蛋白的重要对象。经基因重组技术改造后的ge蛋白在中国仓鼠卵巢细胞(cho)中表达特异性抗原制成重组亚单位疫苗，刺激机体产生th1型免疫应答，对免疫力低下的人群有很好的保护效果。

2、近些年来，围绕重组带状疱疹蛋白上游工艺及免疫原性的探究层出不穷，但下游纯化工艺尚不成熟。在生物制品生产过程中，宿主细胞系中表达目标蛋白时会产生来自宿主细胞的结构蛋白和分泌蛋白(hcp)，刺激人体免疫系统产生不良反应。因此开发纯化工艺时需要检测hcp残留，特别对于重组带状疱疹蛋白，hcp残留往往需要从几十万ppm降低至几百ppm。

3、在目标蛋白上携带标签，采用亲和层析来纯化能够获得较纯的产物，但后续需要切除标签，操作难度大，并且在酶切的过程容易产生难以去除的副产物，往往适用于小批量纯化来探究重组带状疱疹的生物学功能。日益精进的层析介质给纯化方式带来更多的选择，经疏水、离子交换或分子筛等层析方式能够纯化出目标产物。传统的纯化工艺采用阴离子交换层析进行捕获，疏水作用层析进行中度纯化，多模式弱阳离子交换介质进行精细纯化，uf/df换液后使用分子筛来去除痕量杂质。传统工艺所使用的介质中包含分子筛使得纯化成本高、步骤繁琐，操作难度大，亟需探索出新的纯化工艺来进行国产化介质替换并有效去除hcps。

技术实现思路

1、针对以上技术问题，本发明的目的在于提供一种纯化重组带状疱疹蛋白的方法，具有流程短、操作简便且质量稳定的特点，纯化后的蛋白可达质量要求：纯度≥95％及宿主细胞蛋白残留<500ppm。

2、为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

3、一种纯化重组带状疱疹蛋白的方法，包括：

4、将重组带状疱疹蛋白的粗分离样品溶液依序经过diamond mix-a、diamond butylmustang、diamond q和diamond mix-amustang作为层析介质的四步纯化步骤。

5、上述方案中，diamond mix-a是通过两次交联分别将苯基缩水甘油醚和2,3-环氧丙基三甲基氯化铵两种基团偶联在高刚性琼脂糖微球上形成的一种多模式强阴离子交换介质，该种介质不仅具有离子交换功能，还具有疏水和氢键作用，可以有效地去除聚体、dna、宿主蛋白、内毒素、proteina等杂质。

6、上述方案中，diamond butyl mustang是以细颗粒高刚性琼脂糖为基架键合疏水性丁基基团而制成，具有分辨率高、反压低的特点，适用于蛋白下游纯化的中度纯化和精细纯化阶段。

7、上述方案中，diamond q是将季铵基偶联在高刚性琼脂糖微球上形成的一种强阴离子交换介质，具有较高的耐压性与载量。

8、上述方案中，diamond mix-amustang是通过两次交联分别将苯基缩水甘油醚和2,3-环氧丙基三甲基氯化铵两种基团偶联在颗粒较小的高刚性琼脂糖微球上形成的一种多模式强阴离子交换介质，这种介质可以用于生物分子的纯化，特别是在抗体纯化中作为精纯步骤。

9、作为优选方案，所述重组带状疱疹蛋白粗分离样品过0.45μm滤膜后直接进行diamond mix-a多模式强阴离子层析。

10、作为优选方案，所述diamond mix-a为多模式强阴离子交换介质，将其作为层析介质的纯化步骤1，工艺条件包括：所述重组带状疱疹蛋白的上样量为7～9mg/ml、接触时间为5～7min、上样蛋白浓度为≤7.5mg/ml；使用缓冲液组合1，所述缓冲液组合1包括平衡缓冲液1、清洗缓冲液1及洗脱缓冲液1，具体组成及参数控制为：

11、平衡缓冲液1：15～25mm pb，ph6.5～7.5；

12、清洗缓冲液1：15～25mm柠檬酸+0.20～0.30m精氨酸盐酸盐，ph4.5～5.5；

13、洗脱缓冲液1：15～25mm柠檬酸+0.40～0.60m精氨酸盐酸盐，ph4.5～5.5。

14、在洗脱过程中收集洗脱峰75～75mau/mm，得到diamond mix-a的洗脱液。

15、作为优选方案，所述diamond mix-a层析的洗脱液用饱和硫酸铵和1mtris分别调节电导和ph和diamond butyl mustang的平衡缓冲液保持一致后进行diamond butylmustang疏水作用层析。

16、作为优选方案，所述diamondbutyl mustang为疏水作用层析介质，将其作为层析介质的纯化步骤2，工艺条件包括：将调节电导和ph的diamond mix-a层析的洗脱液进行上样，上样量为7～9mg/ml、接触时间为5～7min；使用缓冲液组合2，所述缓冲液组合2包括平衡缓冲液2、清洗缓冲液2及洗脱缓冲液2，具体组成及参数控制为：

17、平衡缓冲液2：15～25mm pb+0.50～0.70m硫酸铵，ph6.5～7.5；

18、清洗缓冲液2：15～25mm pb+0.05～0.15m硫酸铵，ph6.5～7.5；

19、洗脱缓冲液2：40～60mm pb，ph6.5～7.5。

20、在洗脱过程中收集洗脱峰25～25mau/mm，得到diamond butyl mustang的洗脱液。

21、作为优选方案，所述diamond q为强阴离子交换介质，将其作为层析介质的纯化步骤3，工艺条件包括：将diamondbutyl mustang的洗脱液直接进行上样，上样量为4mg/ml、接触时间为5～7min；使用缓冲液组合3，所述缓冲液组合3包括平衡缓冲液3、清洗缓冲液3及洗脱缓冲液3，具体组成及参数控制为：

22、平衡缓冲液3：15～25mm pb，ph6.5～7.5；

23、清洗缓冲液3：15～25mm pb+0.20～0.30m氯化钠，ph6.5～7.5；

24、洗脱缓冲液3：15～25mm pb+0.30～0.35m氯化钠，ph6.5～7.5。

25、在更换洗脱缓冲液后1cv，洗脱峰明显上升时开始收集洗脱液3cv，得到diamond q的洗脱液。

26、作为优选方案，所述diamond mix-amustang为多模式强阴离子交换介质，将其作为层析介质的纯化步骤4，工艺条件包括：将diamond q的洗脱液直接进行上样，上样量为4mg/ml、接触时间为5～7min；使用缓冲液组合4，所述缓冲液组合4包括平衡缓冲液4、清洗缓冲液4及洗脱缓冲液4，具体组成及参数控制为：

27、平衡缓冲液4：15～25mm pb，ph6.5～7.5；

28、清洗缓冲液4：15～25mm柠檬酸+0.25～0.35m精氨酸盐酸盐，ph4.5～5.5；

29、洗脱缓冲液4：15～25mm柠檬酸+0.40～0.50m精氨酸盐酸盐，ph4.5～5.5。

30、在更换洗脱缓冲液后1cv，洗脱峰明显上升时开始收集洗脱液4cv，洗脱过程中出现的双峰均是目的蛋白，得到纯化后的重组带状疱疹蛋白原液。

31、作为优选方案，各纯化步骤中，保持样品、溶液和环境温度均在22～24℃之间。

32、作为优选方案，所述重组带状疱疹蛋白的分子量为89.6kda、表达量为2.8～7.5g/l、等电点为5.52及消光系数为1.28。

33、本发明采用以上技术方案至少具有如下的有益效果：

34、1.本发明所筛选的多种层析介质中，多模式强阴离子交换介质包括diamond mix-a和diamond mix-a mustang能够有效去除hcp、杂质及小部分色素；疏水作用介质diamondbutyl mustang使纯化方案具有连贯性，去除大部分色素，并进一步去除杂质和hcp；强阴离子交换介质为diamond q，其去除hcp效果较好；

35、2.本发明所开发出的工艺条件中，diamond mix-a和diamond mix-amustang使用精氨酸盐酸盐溶液作为清洗和洗脱缓冲液，能够最大程度的去除hcp；

36、3.本发明提供一套优选方案纯化重组带状疱疹蛋白，粗分离样品经diamond mix-a、diamond butyl mustang、diamond q和diamond mix-amustang纯化的样品纯度>97％，hcp残留降低至200ppm左右；此纯化方法不包括分子筛，具有流程短、操作简便且质量稳定的特点，纯化后的蛋白可达质量要求：纯度≥95％及宿主细胞蛋白残留<500ppm；不同类型的带状疱疹，种类不同，质量要求不同，因此，层析介质的属性要求也会存在差异。