一种含有糖脂类表面活性剂体系中脂肪酶活力的测定方法

一、：本发明涉及脂肪酶活力的检测，具体涉及一种含有糖脂类表面活性剂体系中脂肪酶活力的测定方法。

背景技术

0、二、背景技术：

1、获得高催化活性的脂肪酶是研究人员和生产者的共同目标，酶活测定方法成为脂肪酶研究过程中至关重要的环节。目前，脂肪酶活力测定方法主要分为碱滴定法和分光光度法两大类。碱滴定法操作简单，但对单一样品的检测时间较长，且当酶活较低时无法检测。分光光度法主要有铜皂法和对硝基苯酚法(p-npp法)，相比于铜皂法，对硝基苯酚法的操作过程更简单且所用试剂毒性较低。因此，目前多数研究更偏向于采用对硝基苯酚法测定脂肪酶活。

2、实验室前期研究，发现蚜虫莫氏黑粉(moesziomycesaphidis，m.aphidis)能够利用葡萄糖为碳源发酵合成脂肪酶，利用对硝基苯酚法测得最高酶活达83.14±1.09u/ml。以植物油为碳源时，m.aphidis可以代谢合成甘露糖赤藓糖醇脂(mannosylerythritollipids,mels)，已有研究发现脂肪酶在mels合成过程中具有重要作用，推测m.aphidis可以利用植物油合成脂肪酶。然而，传统的对硝基苯酚法无法准确测定m.aphidis利用植物油合成的脂肪酶活力。鉴于此，开发一种能够有效测定m.aphidis利用植物油合成的脂肪酶活力是至关重要的。

技术实现思路

0、三、技术实现要素：

1、本发明要解决的技术问题是：根据现有传统的对硝基苯酚法无法准确测定蚜虫莫氏黑粉菌m.aphidis利用植物油合成的脂肪酶活力，对比m.aphidis发酵的两种培养基组分及合成产物区别，发现单产脂肪酶的培养基碳源为葡萄糖，而联产的发酵培养基碳源为植物油，且发酵联产的产物为脂肪酶和mels，推断植物油、mels是影响发酵联产中脂肪酶活性测定的关键因素。因此，本发明以前期研究确定的酶活测定p-npp法为基础，明确油脂和糖脂是发酵体系中脂肪酶活力测定的限制因素，确定消除限制因素的方法和条件，优化建立了适用于以植物油为碳源发酵联产mels和脂肪酶时的酶活测定方法，并利用当前研究较为广泛的糖脂类表面活性剂和不同种类的市售脂肪酶制剂构建模拟体系，对新建立的酶活测定方法进行适用性和准确性验证。即本发明提供一种含有糖脂类表面活性剂体系中脂肪酶活力的测定方法。

2、为了解决上述问题，本发明采取的技术方案是：

3、本发明提供一种富含糖脂类表面活性剂体系中脂肪酶活力的测定方法，所述测定方法包括以下步骤：

4、1)利用微生物合成糖脂类生物表面活性剂过程中，在培养发酵所得发酵体系即发酵液中加入有机溶剂进行萃取；

5、2)萃取后进行超声处理；

6、3)超声处理后进行离心分离；

7、4)将分离后所得含有脂肪酶的水相用超纯水进行稀释，取稀释后的水相与反应底物进行混合，然后在70℃下水浴反应10min，接着加入无水乙醇终止反应，12000r/min条件下离心5min，410nm下测定吸光度并计算对硝基苯酚(p-np)浓度；

8、所述稀释时的倍数记为n，加入反应体系的水相体积记为v0，反应底物的体积记为v1，无水乙醇的体积记为v2；所述410nm下测定吸光度记为od410；所述对硝基苯酚的浓度记为cp；

9、对硝基苯酚p-np浓度的计算公式：cp＝(od410-b)/a；其中：

10、cp—体系中的对硝基苯酚p-np的浓度，μmol/l；

11、od410—体系在410nm下测定的吸光度；

12、b—为吸光值与对硝基苯酚(p-np)浓度标准曲线中的截距；

13、a—为吸光值与对硝基苯酚(p-np)浓度标准曲线中的斜率；

14、(脂肪酶活力测定实验时，配制不同浓度对硝基苯酚(p-np)溶液，并测定od410，进行线性回归计得到a、b的值)；

15、5)脂肪酶活力的计算：

16、(脂肪酶活力的定义：1ml酶液中，一定条件下催化水解底物p-npp，每分钟生成1μmol对硝基苯酚(p-np)，即为1个活力单位，以u/ml表示)；

17、脂肪酶活力计算公式：其中：

18、x—样品中脂肪酶活力，u/ml；

19、cp—反应结束后体系中的对硝基苯酚(p-np)浓度，μmol/l；

20、v—反应体系总体积(v0+v1+v2)，μl；

21、v0—反应体系中加入含有脂肪酶的水相体积，μl；

22、n—含有脂肪酶的水相稀释倍数，反应后的od410超过1.2需要将脂肪酶液进行稀释，如未稀释，则n为1；

23、10—反应时间，min；

24、1000—u/l到u/ml的转换系数。

25、根据上述的富含糖脂类表面活性剂体系中脂肪酶活力的测定方法，步骤1)所述萃取时采用的有机溶剂为正己烷、石油醚60-90或异辛烷。

26、根据上述的富含糖脂类表面活性剂体系中脂肪酶活力的测定方法，步骤1)所述有机溶剂的加入量占发酵液总体积的40～80％。

27、根据上述的富含糖脂类表面活性剂体系中脂肪酶活力的测定方法，步骤2)所述超声处理时的条件为：在100～140w条件下超声1min。

28、根据上述的富含糖脂类表面活性剂体系中脂肪酶活力的测定方法，步骤3)所述离心分离时，转速为4000～6000r/min、时间为1～3min。

29、根据上述的富含糖脂类表面活性剂体系中脂肪酶活力的测定方法，步骤4)中所述水相、反应底物和无水乙醇三者之间加入的体积比为1:24:20。

30、根据上述的富含糖脂类表面活性剂体系中脂肪酶活力的测定方法，步骤4)中所述反应底物的制备方法为：将30.0mg对硝基苯酚棕榈酸酯(p-npp)溶解于10.0ml异丙醇、100.0ml、0.05mmol/l的tris-hcl中混合配制而成。

31、采用本发明技术方案测定含糖脂的酶液中脂肪酶活力，测得酶活与不含糖脂类表面活性剂的体系中脂肪酶活力基本无差别，表明本发明方法对含糖脂类表面活性剂的酶液中酶活测定有广泛适用性和稳定性。

32、本发明的积极有益效果：

33、1、本发明建立的脂肪酶活力测定方法测得酶活与不含糖脂类表面活性剂的体系中测得脂肪酶活力无显著差别，对含糖脂类表面活性剂的酶液中酶活测定有广泛适用性和稳定性，为进一步研究鼠李糖脂、槐糖脂和甘露糖赤藓糖醇脂等糖脂类表面活性剂生物合成发酵液中的脂肪酶活力变化和调控机制研究奠定基础。

34、2、本发明建立的脂肪酶活力测定方法有效解决了富含糖脂类表面活性剂体系中的脂肪酶活力测定不准确的问题，为准确评价糖脂和脂肪酶两种产品的联产效果和进一步实现产品效益的增加奠定基础。

技术特征：

1.一种富含糖脂类表面活性剂体系中脂肪酶活力的测定方法，其特征在于，所述测定方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的富含糖脂类表面活性剂体系中脂肪酶活力的测定方法，其特征在于：步骤1)所述萃取时采用的有机溶剂为正己烷、石油醚60-90或异辛烷。

3.根据权利要求1所述的富含糖脂类表面活性剂体系中脂肪酶活力的测定方法，其特征在于：步骤1)所述有机溶剂的加入量占发酵液总体积的40～80％。

4.根据权利要求1所述的富含糖脂类表面活性剂体系中脂肪酶活力的测定方法，其特征在于，步骤2)所述超声处理时的条件为：在100～140w条件下超声1min。

5.根据权利要求1所述的富含糖脂类表面活性剂体系中脂肪酶活力的测定方法，其特征在于，步骤3)所述离心分离时，转速为4000～6000r/min、时间为1～3min。

6.根据权利要求1所述的富含糖脂类表面活性剂体系中脂肪酶活力的测定方法，其特征在于：步骤4)中所述水相、反应底物和无水乙醇三者之间加入的体积比为1:24:20。

7.根据权利要求1所述的富含糖脂类表面活性剂体系中脂肪酶活力的测定方法，其特征在于，步骤4)中所述反应底物的制备方法为：将30.0mg对硝基苯酚棕榈酸酯p-npp溶解于10.0ml异丙醇、100.0ml、0.05mmol/l的tris-hcl中混合配制而成。

技术总结本发明公开了一种富含糖脂类表面活性剂体系中脂肪酶活力的测定方法。利用微生物合成糖脂类生物表面活性剂过程中，在培养发酵所得发酵液中加入有机溶剂进行萃取，然后超声处理、离心分离；分离后所得含有脂肪酶的水相用超纯水进行稀释，取稀释后的水相与反应底物进行混合、反应，加入无水乙醇终止反应，然后离心、测定410nm下的吸光度并计算得到对硝基苯酚浓度；最后根据脂肪酶活力计算公式计算得到脂肪酶活力。采用本发明测定含糖脂的酶液中脂肪酶活力，测得酶活与不含糖脂类表面活性剂的体系中脂肪酶活力基本无差别，表明本发明方法对含糖脂类表面活性剂的酶液中酶活测定有广泛适用性和稳定性。技术研发人员：牛永武,杨岩晓,牛奔,乔杉,赵仁勇受保护的技术使用者：河南工业大学技术研发日：技术公布日：2024/9/29