改良的菌丝霉素突变体及应用的制作方法

本发明涉及生物工程及生物医药，具体涉及改良的菌丝霉素突变体及应用。

背景技术：

1、因抗菌肽具有特异的破膜作用的抗菌机制，在使用抗菌肽时不易于产生细菌耐药的问题，因此抗菌肽被视为是解决抗生素耐药问题日益突出现状的曙光，有望开发出新型的抗菌药物。结合文献《抗菌肽的设计与优化研究进展》的报导，现今获得抗菌肽的来源主要有以下几种：①从生物体分离纯化鉴定以及结合基因测序获得抗菌肽及其基因序列，并收录在文献报道和全球公共数据库中，如apd3、pepbank、camp、dampd、dramp等数据库；②基于已有的抗菌肽序列进行传统的化学改造与修饰如比如进行截短、氨基酸定点突变、与其它的抗菌肽部分杂合、氨基酸修饰等；③通过计算机辅助如机器学习模型、深度学习神经网络、联合多组学分析与疾病分子的作用机制等的方式进行设计改造或者从头设计。④高通量筛选，如双环肽来源于噬菌体展示肽库的高通量筛选，如广谱抗菌肽rrwrivvirvrr-nh2源于点合成抗菌肽阵列筛选等。

2、但是，目前抗菌肽抑菌活性仅局限于革兰氏阳性菌，抗菌谱拓宽的抗菌肽鲜有报道，因此，有必要深入探索拓宽抗菌肽抗菌谱的合适方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供改良的菌丝霉素突变体及应用，该改良的菌丝霉素突变体既保留了革兰氏阳性菌的抑菌活性，又同时表现出革兰氏阴性菌的抑菌活性，拓宽了菌丝霉素突变体的抗菌谱。

2、为达到以上技术目的，本申请采用的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供改良的菌丝霉素突变体，包括突变体plef2l、突变体plep7l、突变体ples21l、突变体pley25l、突变体pley29l中的至少一种，所述突变体plef2l、所述突变体plep7l、所述突变体ples21l、所述突变体pley25l、所述突变体pley29l的氨基酸序列分别如seq id no.2、seq id no.3、seq id no.5-7所示。

4、第二方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子编码所述的改良的菌丝霉素突变体。

5、第三方面，本发明提供一种载体，所述载体包含所述的核酸分子；优选地，所述载体还包括毕赤酵母表达载体。

6、第四方面，本发明提供一种改良工程菌，所述改良工程菌为能够表达所述的改良的菌丝霉素突变体。

7、优选地，所述改良工程菌包括所述的核酸分子或者所述的载体。

8、第五方面，本发明提供所述的改良的菌丝霉素突变体的制备方法，包括如下步骤：

9、步骤1，以菌丝霉素的三级结构为模板进行同源建模，将菌丝霉素三级结构外侧的氨基酸突变为疏水性氨基酸，所获得的突变体采用毕赤酵母的偏好密码子进行优化；

10、步骤2，将优化后的突变体与表达载体连接，并与α信号肽序列融合构建表达盒；优选地，所述表达载体为毕赤酵母表达载体；

11、步骤3，将构建成功的表达盒在毕赤酵母中表达，突变体表达盒经单酶切线性化后，电击转化毕赤酵母感受态细胞，对各个突变体的转化子进行表达盒的整合检测，对整合成功的转化子进行诱导培养，获得所述改良的菌丝霉素突变体。

12、优选地，所述步骤1中，将所述的核酸分子以“taatag”为双终止密码子，5’端与3’端分别引入限制性酶切位点xhoi与xbai，采用毕赤酵母偏好的密码子优化，获得突变体基因。

13、优选地，所述诱导培养包括：采用bmgy培养基，将转化子于22～30℃、250rpm条件下培养48h，离心去上清；再加入bmmy培养基，于22～30℃、250rpm条件下培养96-120h，每隔24h补加终浓度为0.5％-1％的甲醇；优选地，所述离心条件为：转速4000rpm，离心10min；或者，

14、所述诱导培养包括：采用ypd培养基将转化子于30℃培养48h获得种子液，将种子液接种于含4wt％甘油的bsm培养基中，于ph值5.5，温度30℃，溶氧大于20％，补料连续流加50wt％的甘油，培养至菌体湿重大于150g/l时停止流加甘油，待溶氧上升时，开始流加甲醇至培养结束，0.5～1h后降低温度至28℃继续培养96-120h。

15、第六方面，本发明提供所述的改良的菌丝霉素突变体或者所述的核酸分子或者所述的载体或者所述的改良工程菌在制备抗菌抑菌产品上的应用。

16、优选地，所述菌包括革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌。

17、本发明提供改良的菌丝霉素突变体及应用，该改良的菌丝霉素突变体兼具革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌抑菌活性。目前报道的抗菌肽只能抑制革兰氏阳性菌，本发明通过构建疏水性增强的菌丝霉素突变体，从而将菌丝霉素的抗菌谱扩展至革兰氏阴性菌，为后续新抗菌肽的设计提供了新的构思。

技术特征：

1.改良的菌丝霉素突变体，其特征在于，包括突变体plef2l、突变体plep7l、突变体ples21l、突变体pley25l、突变体pley29l中的至少一种，所述突变体plef2l、所述突变体plep7l、所述突变体ples21l、所述突变体pley25l、所述突变体pley29l的氨基酸序列分别如seq id no.2、seq id no.3、seq id no.5-7所示。

2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的改良的菌丝霉素突变体，优选的，编码所述突变体plef2l、编码所述突变体plep7l、编码所述突变体ples21l、编码所述突变体pley25l、编码所述突变体pley29l的核酸分子序列分别如seq idno.13-17所示。

3.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求2所述的核酸分子；优选地，所述载体还包括毕赤酵母表达载体。

4.一种改良工程菌，其特征在于，所述改良工程菌为能够表达权利要求1所述的改良的菌丝霉素突变体。

5.根据权利要求4所述的改良工程菌，其特征在于，所述改良工程菌包括权利要求2所述的核酸分子或者权利要求3所述的载体。

6.权利要求1所述的改良的菌丝霉素突变体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，将权利要求2所述的核酸分子以“taatag”为双终止密码子，5’端与3’端分别引入限制性酶切位点xhoi与xbai，采用毕赤酵母偏好的密码子优化，获得突变体基因。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述诱导培养包括：采用bmgy培养基，将转化子于22～30℃、250rpm条件下培养48h，离心去上清；再加入bmmy培养基，于22～30℃、250rpm条件下培养96-120h，每隔24h补加终浓度为0.5％-1％的甲醇；优选地，所述离心条件为：转速4000rpm，离心10min；或者，

9.权利要求1所述的改良的菌丝霉素突变体或者权利要求2所述的核酸分子或者权利要求3所述的载体或者权利要求4或5所述的改良工程菌在制备抗菌抑菌产品上的应用。

10.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述菌包括革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌。

技术总结本发明提供改良的菌丝霉素突变体及应用，包括突变体PLEF2L、突变体PLEP7L、突变体PLES21L、突变体PLEY25L、突变体PLEY29L中的至少一种，所述突变体PLEF2L、所述突变体PLEP7L、所述突变体PLES21L、所述突变体PLEY25L、所述突变体PLEY29L的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5‑7所示。本发明提供改良的菌丝霉素突变体及应用，该改良的菌丝霉素突变体兼具革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌抑菌活性，为后续新抗菌肽的设计提供了新的构思。技术研发人员：刘陈立,李嘉盛,蒙海林,徐梦珂,刘复荣受保护的技术使用者：广州先进技术研究所技术研发日：技术公布日：2024/9/29