一种灭草松半抗原、抗体、杂交瘤细胞株及其应用

本发明涉及食品安全免疫检测领域，尤其是指一种灭草松半抗原、抗体、杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术：

1、灭草松(bentazone)选择性的苯并噻二唑类除草剂，商品名有苯达松、排草丹和百草克，主要用于苗后水稻、花生、玉米和大豆等作物的阔叶杂草和莎草的防除，兼具触杀性和选择性。灭草松的作用靶标位点为光合系统psii的d1蛋白，主要通过抑制杂草的光合作用、水分代谢等生理机制来起到除草的作用，能用于多种耕作方式和多种农作物。灭草松在世界范围内被广泛使用，进入我国市场已有30多年，它在土壤中具有较高的迁移率，很难被吸附，容易造成土壤及水体污染。灭草松属于中低毒性农药，研究表明人体摄入后会刺激皮肤，引起腹泻、呕吐，严重时会导致急性肾衰竭、肝炎、心脏骤停等一系列严重疾病，对人类健康构成巨大威胁。目前，对灭草松残留的检测方法主要是仪器分析方法，包括离子色谱法、气相色谱-质谱串联法、液相色谱串联质谱法等。这些方法结果可靠，灵敏度高，已有相关的技术标准可供参考。但由于需要昂贵的仪器、专业的操作人员，以及样品前处过程复杂、成本高昂、检测时间长，不能很好地满足快速简便的现场检测要求。

2、因此建立快速简便的灭草松检测方法具有重要意义。酶联免疫法(elisa)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，适用于大量样本的现场快速检测，为灭草松检测提供了一种新的检测途径。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明从灭草松类似物6-羟基灭草松出发，与6-溴己酸抑制反应生成酯键再通过水解得到最终抗原，在完全保留灭草松化学结构的基础上，引入“6c”间隔臂、末端为羧基的化合物作为半抗原，结合蛋白从而制备完全抗原。本发明中的半抗原最大程度上保留了灭草松的原有结构，且边侧的羧基偶联蛋白后，灭草松的特异识别位点更容易被暴露，相比较而言，本发明中抗灭草松单克隆抗体的灵敏度更高，为食品中灭草松残留量的检测提供更灵敏、迅速的检测方法。

2、本发明通过以下技术方案实现：

3、本发明第一个目的是提供一种灭草松半抗原，所述灭草松半抗原的结构式为：

4、

5、本发明第二个目的是提供一种灭草松半抗原的制备方法，包括以下步骤：

6、在有机溶剂中，将6-羟基灭草松与k2co3于室温下搅拌反应，加入6-溴己酸乙酯反应，得到化合物1；将化合物1溶解于naoh与无水乙醇的混合溶液中回流搅拌，得到灭草松半抗原。

7、其中，所述化合物1的结构式为：

8、

9、所述有机溶剂选自n,n-二甲基甲酰胺。

10、本发明第三个目的是提供一种灭草松人工抗原，由所述灭草松半抗原与载体蛋白制备得到。

11、在本发明的一些实施例中，所述载体蛋白选自钥孔血蓝蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、乳铁蛋白、辣根过氧化物酶、甲状腺球蛋白、免疫球蛋白、激素和卵清蛋白中的至少一种。

12、本发明第四个目的是提供一株分泌灭草松单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株由权利要求1所述灭草松半抗原通过合成灭草松完全抗原，免疫小鼠得到；所述杂交瘤细胞株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期为2024年04月18日，保藏编号为cgmcc no.45903。

13、本发明第五个目的是提供一种灭草松单克隆抗体，由所述杂交瘤细胞株分泌产生。

14、本发明第六个目的是提供一种组合物，所述组合物中含有所述的杂交瘤细胞株和/或所述的灭草松单克隆抗体。

15、本发明第七个目的是提供一种试剂盒，所述试剂盒中含有所述的杂交瘤细胞株、所述的灭草松单克隆抗体和所述的组合物中的至少一种。

16、本发明第八个目的是提供一种试纸条，所述试纸条含有所述的杂交瘤细胞株、所述的灭草松单克隆抗体和所述的组合物中的至少一种。

17、本发明第九个目的是提供所述的杂交瘤细胞株、所述的灭草松单克隆抗体、所述的组合物、所述的试剂盒或所述的试纸条在检测灭草松中的应用。

18、本发明还提供了分泌抗灭草松单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备基本步骤为：

19、(1)灭草松半抗原的制备：

20、称取6-羟基灭草松(512.6mg,2.0mmol)溶解于3mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，加入k2co3(2.8g，20.0mmol)于室温下搅拌反应30min。随后，称取6-溴己酸乙酯(535.5mg，2.4mmol)加入上述反应液中，65℃回流搅拌反应24h。反应完成后，在氮气保护下吹干反应液，加入1.5ml纯水和1.5ml乙酸乙酯，萃取3次，收集上层液体并吹干。将吹干后的残余物溶解于naoh与无水乙醇的混合溶液中，80℃回流搅拌2h。最后，加稀盐酸酸化至溶液ph为5，用乙酸乙酯萃取，收集有机相溶液，减压除去溶剂得浅黄色油状化合物。

21、(2)灭草松完全抗原的制备：采用碳二亚胺法将灭草松半抗原分别与载体蛋白klh和bsa偶联制备免疫原灭草松-klh和包被原灭草松-bsa，通过透析除去与未载体蛋白偶联的半抗原；

22、(3)小鼠免疫：将免疫原灭草松-bsa与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过颈、背部皮下注射免疫balb/c小鼠；首次免疫采用完全弗氏佐剂，多次加强免疫采用不完全弗氏佐剂，首次免疫与第一次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天，最后用生理盐水直接稀释的免疫原灭草松-klh(不含佐剂)进行冲刺免疫；通过间接竞争酶联免疫法(ic-elisa)检测小鼠抗血清的效价和抑制；

23、(4)细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇(peg，分子量为4000)法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过hat培养基培养，利用间接竞争酶联免疫法(ic-elisa)检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-elisa测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制效果的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得交瘤细胞株；

24、(5)杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-elisa测定灵敏度和特异性。

25、本发明的有益效果：

26、本发明提供的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，对灭草松具有较好的特异性和检测灵敏度(ic50值为1.70ng/ml)，可实现水果蔬菜等食品中灭草松残留量的检测，为食品中灭草松残留的免疫学检测提供了原料，具有实际应用价值。

27、生物材料保藏:一株分泌抗灭草松单克隆抗体的杂交瘤细胞株nhea，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期为2024年04月18日，保藏编号为cgmcc no.45903。

技术特征：

1.一种灭草松半抗原，其特征在于，所述灭草松半抗原的结构式为：

2.一种灭草松半抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.一种灭草松人工抗原，其特征在于，由权利要求1所述灭草松半抗原与载体蛋白制备得到。

4.根据权利要求3所述灭草松人工抗原，其特征在于，所述载体蛋白选自钥孔血蓝蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、乳铁蛋白、辣根过氧化物酶、甲状腺球蛋白、免疫球蛋白、激素和卵清蛋白中的至少一种。

5.一株分泌灭草松单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株由权利要求1所述灭草松半抗原通过合成灭草松完全抗原，免疫小鼠得到；所述杂交瘤细胞株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期为2024年04月18日，保藏编号为cgmcc no.45903。

6.一种灭草松单克隆抗体，其特征在于，由权利要求5所述杂交瘤细胞株分泌产生。

7.一种组合物，其特征在于，所述组合物中含有权利要求5所述的杂交瘤细胞株和/或权利要求6所述的灭草松单克隆抗体。

8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求5所述的杂交瘤细胞株、权利要求6所述的灭草松单克隆抗体和权利要求7所述的组合物中的至少一种。

9.一种试纸条，其特征在于，所述试纸条含有权利要求5所述的杂交瘤细胞株、权利要求6所述的灭草松单克隆抗体和权利要求7所述的组合物中的至少一种。

10.权利要求5所述的杂交瘤细胞株、权利要求6所述的灭草松单克隆抗体、权利要求7所述的组合物、权利要求8所述的试剂盒或权利要求9所述的试纸条在检测灭草松中的应用。

技术总结本发明涉及一种灭草松半抗原、抗体、杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明分泌抗灭草松单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏日期为2024年04月18日，保藏编号为CGMCC No.45903。该细胞株分泌的抗灭草松单克隆抗体，能够用于食品安全检测中灭草松残留的分析检测。本发明获得的抗灭草松单克隆抗体细胞株可用于免疫分析检测，其对灭草松有较好的检测灵敏度和特异性(IC<subgt;50</subgt;值为1.70ng/mL)。本发明成果可用于制备灭草松的免疫检测试剂盒以及胶体金试纸条，为水果、蔬菜等食品中灭草松残留量的检测提供有力的检测方法与手段。技术研发人员：孙茂忠,张庆,胥传来,匡华,徐丽广,吴晓玲,刘丽强,郝昌龙,宋珊珊,吴爱红,郭玲玲,胥欣欣,瞿爱华受保护的技术使用者：江南大学技术研发日：技术公布日：2024/9/29