一种安罗替尼纳米制剂及其制备方法及应用与流程

本发明涉及医药，尤其涉及一种安罗替尼纳米制剂及其制备方法及应用。

背景技术：

1、持续的血管生成能力为肿瘤的重要标志，在肿瘤进展过程中观察到持续且不受调节的血管生成。肿瘤脉管系统会阻碍有效浓度的治疗药物的输送，减少有效放射治疗所需的肿瘤氧合，同时也影响免疫细胞的浸润。抗血管生成疗法以剥夺肿瘤的氧气和营养为目的，导致肿瘤坏死以达到抗肿瘤的目的，然而，临床使用抗血管生成疗法产生了肿瘤侵袭和扩散能力增强、缺氧(血管过度修剪)引起代偿性血管再生等问题，抗血管生成疗法的有效性受到质疑。血管正常化理论的提出开辟了抗血管生成疗法的新时代。通过修剪不成熟(周细胞覆盖率低)的血管，重塑剩余的血管，降低血管通透性，增加肿瘤血液灌注，实现肿瘤脉管系统正常化，进而提高药物递送效率和改善免疫细胞浸润情况，这样的疗法被称为“血管正常化疗法”。肿瘤脉管系统作为肿瘤微环境(tumor microenvironment，tme)中血液灌注、免疫细胞浸润和肿瘤细胞转移的重要通道，与tme的免疫状态息息相关，血管正常化有望改善tme的免疫状态。

2、浸润到肿瘤及其周围区域的巨噬细胞称为肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associatedmacrophages，tams)，它是tme中数量最丰富，且最为活跃的免疫细胞，在多种恶性肿瘤的进展和免疫逃逸中发挥重要作用。此外，tams密度与高度血管化区域之间存在相关性，而且tams还与抗血管生成药物的耐药性有关。vegf通过vegfr1/flt1受体作用于单核细胞，促进单核细胞向肿瘤组织趋化；tams通过提供关键的促血管生成因子vegf来促进血管生成。因此，可以说抗血管生成治疗的活性是由tams调节的。tams不仅直接促进肿瘤进展，也通过促进肿瘤血管生成以推动肿瘤的侵袭与转移，同时靶向tams和肿瘤脉管系统的治疗策略有望转变tme免疫抑制特性，促进tme正常化。

3、唾液酸(sialic acid，sa)是一类带有负电荷的9-碳单糖及其衍生物的总称。sa能发挥“免疫伪装”的作用，而在更多的情况下，sa主要参与许多抗原识别的过程，介导与体内特定受体的相互作用。聚唾液酸(polysialic acid，psa)是sa单体以α-2,8-、α-2,9-、或α-2,8-/α-2,9-交替的糖苷键连接而成的直链聚合物，同样具有sa的受配体介导作用。恶性肿瘤细胞表面sa异常高表达，会“驯化”周围的肿瘤相关免疫细胞普遍高表达sa结合受体。sa与其受体之间通过传递免疫抑制信号，建立并维持tme，从而促进肿瘤生长，帮助肿瘤免疫逃逸。其中siglec-1一般表达于单核细胞及巨噬细胞表面，尤其在脾、骨髓和淋巴结等巨噬细胞上高表达，在tams表面也有高表达，而在正常外周血单核细胞上并不表达。当单核细胞受到炎症刺激时，siglec-1表达迅速上调。tams很难实现肿瘤部位原位增殖，大多数tams起源于单核细胞，单核细胞在肿瘤部位炎症因子的招募下不断进入肿瘤，在肿瘤内分化，成为tams。根据tams的来源途径和分化过程，“mps通路”的肿瘤递药策略应运而生，其在单核细胞募集过程中将纳米制剂递送至肿瘤组织，实现tams和肿瘤细胞的双重杀伤。基于“mps通路”的sa靶向递药策略着眼于大环境，扩大肿瘤治疗靶标的范围，不仅仅局限于杀伤肿瘤细胞，而是通过对单核细胞和tams的靶向与干预作用，调节机体免疫平衡，从源头上改善免疫抑制的肿瘤相关微环境，甚至是肿瘤所处的大环境。

4、安罗替尼(anlotinib hydrochloride，anb)，是中国自主研发的小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂。安罗替尼主要通过使vegfr/pi3k/akt信号通路失活来抑制肿瘤细胞增殖和侵袭。与其他酪氨酸激酶抑制剂相比，安罗替尼具有以下几个优势：高效特异性抑制vegfr-2和vegfr-3，多靶点抑制肿瘤血管生成，有效剂量低。目前安罗替尼上市剂型为口服胶囊剂，雄性大鼠中的口服生物利用度为36.6±9.7％。此外，安罗替尼在生理条件下带正电，表现出较高的蛋白结合能力，降低了血浆中游离药物的浓度，导致其在肿瘤内的有效剂量减少，限制了安罗替尼发挥抗肿瘤作用。

5、因此，如何提供一种新的安罗替尼制剂，以改善安罗替尼的生物利用度、降低血浆蛋白结合率，提高抗肿瘤疗效并且降低安罗替尼的毒副作用，是本领域亟需解决的技术问题。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种唾液酸衍生物修饰的安罗替尼脂质体以及一种聚唾液酸修饰的安罗替尼静电复合物，这两种纳米制剂通过注射能够有效改善现有安罗替尼口服胶囊剂的生物利用度，同时由于本发明中聚唾液酸带负电荷，能够与带正电荷的安罗替尼结合，降低安罗替尼与血浆蛋白的结合率，而脂质体纳米制剂由于将安罗替尼包裹在内水相中，也可以降低安罗替尼与血浆蛋白的结合率，从而提高抗肿瘤疗效并且降低安罗替尼的毒副作用。

2、基于此，提出如下技术方案。

3、首先，本发明提供了一种唾液酸衍生物修饰的安罗替尼脂质体，包括：安罗替尼、磷脂、胆固醇和唾液酸衍生物；

4、其中，安罗替尼与磷脂的质量比为1：(5～20)；

5、磷脂、胆固醇和唾液酸衍生物的摩尔比为(40～60)：(35～45)：(2～10)。

6、优选地，安罗替尼与磷脂的质量比为1：(8～12)。

7、优选地，磷脂、胆固醇和唾液酸衍生物的摩尔比为(50～60)：(35～45)：(2～8)。

8、优选地，所述唾液酸衍生物修饰的安罗替尼脂质体还包括：建立梯度物质、乙醇和水。

9、在一些实施方案中，唾液酸衍生物修饰的安罗替尼脂质体的粒径为100nm～120nm，优选为100nm～115nm。

10、在一些实施方案中，所述的唾液酸衍生物由唾液酸甲酯、唾液酸乙酯或唾液酸与月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸或硬脂酸通过化学键偶联得到。

11、在一些实施方案中，所述的唾液酸衍生物包括唾液酸-胆固醇偶联物(sialicacid-cholesterol conjugate，sa-ch)、唾液酸-十四胺、唾液酸-十六胺、唾液酸-十八胺、唾液酸甲酯-十六酸、唾液酸甲酯-十八酸、唾液酸乙酯-十六酸、唾液酸乙酯-十八酸、唾液酸-十六酸、唾液酸-十八酸中的至少一种；优选为唾液酸-胆固醇偶联物。

12、其中，唾液酸-胆固醇偶联物的化学式如下：

13、

14、唾液酸-十四胺的化学式如下：

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16、唾液酸-十六胺的化学式如下：

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18、唾液酸-十八胺的化学式如下：

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20、唾液酸甲酯-十六酸的化学式如下：

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22、唾液酸甲酯-十八酸的化学式如下：

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24、唾液酸乙酯-十六酸的化学式如下：

25、

26、唾液酸乙酯-十八酸的化学式如下：

27、

28、唾液酸-十六酸的化学式如下：

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30、唾液酸-十八酸的化学式如下：

31、

32、在一些实施方案中，所述的磷脂包括磷脂酰胆碱(pc)、磷脂酰甘油(pg)、磷脂酸(pa)、磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰丝氨酸(ps)、磷脂酰肌醇(pi)、神经鞘磷脂(sm)、心磷脂、氢化大豆磷脂(hspc)、羟乙基磷脂酰胆碱(hepc)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)中的至少一种；优选为氢化大豆磷脂、羟乙基磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱中的至少一种；更优选为氢化大豆磷脂。

33、在一些实施方案中，所述磷脂可以是天然的、半合成的或全合成的。

34、在一些实施方案中，所述安罗替尼为安罗替尼药学上可接受的盐，优选为安罗替尼盐酸盐。

35、进一步，本发明提供了上述任一实施方案中所述的唾液酸衍生物修饰的安罗替尼脂质体的制备方法，包括：

36、(1)将磷脂、胆固醇和唾液酸衍生物用有机溶剂溶解后，得到膜材溶液，去除有机溶剂制得膜材浓缩液，将所述膜材浓缩液与建立梯度物质溶液混合后制得空白脂质体初品；

37、(2)将所述空白脂质体初品经过过滤膜挤出后制得唾液酸衍生物修饰的脂质体混悬液；

38、(3)除去唾液酸衍生物修饰的脂质体混悬液外水相中的建立梯度物质，制得梯度脂质体混悬液；

39、(4)将所述梯度脂质体混悬液与安罗替尼溶液混合后制得所述唾液酸衍生物修饰的安罗替尼脂质体。

40、在一些实施方案中，所述建立梯度物质为柠檬酸-柠檬酸钠、乙二胺四乙酸铵、硫酸铵、枸橼酸铵、蔗糖八硫酸酯铵中的至少一种；优选为硫酸铵。

41、在一些实施方案中，硫酸铵溶液的浓度为140～250mmol/l，优选为150～200mmol/l。

42、采用上述浓度的硫酸铵溶液作为水化介质时，空白脂质体初品的包封率更高。

43、在一些实施方案中，所述制备方法包括：

44、在一些实施方案中，(1)将磷脂、胆固醇和唾液酸衍生物用乙醇在55～70℃溶解后，去除乙醇制得膜材，将所述膜材与建立梯度物质溶液混合后，在55～70℃搅拌孵育10～30min，制得空白脂质体初品；

45、(2)在55～70℃将所述空白脂质体初品经过过滤膜挤出后制得唾液酸衍生物修饰的脂质体混悬液；

46、(3)除去唾液酸衍生物修饰的脂质体混悬液外水相中的建立梯度物质，制得梯度脂质体混悬液；

47、(4)将所述梯度脂质体混悬液与安罗替尼溶液混合后，在55～70℃下孵育15～40min制得所述唾液酸衍生物修饰的安罗替尼脂质体。

48、在一些实施方案中，步骤(4)中，在55～65℃下孵育15～25min。

49、在上述载药温度和载药时间的条件下，制备的唾液酸衍生物修饰的安罗替尼脂质体的包封率均可达到90％以上且粒径较小。

50、在一些实施方案中，步骤(3)中，除去唾液酸衍生物修饰的脂质体混悬液外水相中的建立梯度物质的方法包括：离子交换法、透析法、凝胶过滤法、超滤法中的至少一种。

51、优选地，采用离子交换法除去唾液酸衍生物修饰的脂质体混悬液外水相中的建立梯度物质，包括：将唾液酸衍生物修饰的脂质体混悬液上样于经离心预处理的混合离子交换树脂柱顶端，停留8～10min，然后离心、加水离心3次以上后，制得梯度脂质体混悬液。

52、优选地，所述离心的转速为2000～3000r/min。

53、在一些实施方案中，空白脂质体初品中无水乙醇的体积占比为5～10％。

54、在一些实施方案中，步骤(2)中，在55～70℃将所述空白脂质体初品依次经过0.4～0.08μm的过滤膜挤出后制得唾液酸衍生物修饰的脂质体混悬液，优选地，所述过滤膜为聚碳酸酯膜。

55、在一些实施方案中，步骤(1)中，将建立梯度物质溶液以1～5ml/min的速度加入至膜材中。

56、同时，本发明还提供了一种聚唾液酸修饰的安罗替尼静电复合物，由聚唾液酸与安罗替尼或其药学上可接受的盐通过静电作用及氢键作用结合形成。

57、在一些实施方案中，所述聚唾液酸修饰的安罗替尼静电复合物的粒径为100nm～170nm，优选为100nm～120nm。

58、在一些实施方案中，所述聚唾液酸的聚合度为2～600，优选为2～270；所述聚唾液酸的平均分子量为600da～100kda；优选分子量为3000da～80kda，更优选为10kda～70kda。

59、进一步，本发明提供了上述任一实施方案中聚唾液酸修饰的安罗替尼静电复合物的制备方法，包括：将聚唾液酸溶液与安罗替尼或其药学上可接受的盐溶液混合后制得。

60、在一些实施方案中，所述聚唾液酸与安罗替尼或其药学上可接受的盐的质量比为(1.5～4):1，优选为(1.5～3):1，更优选为(1.5～2.5):1。

61、本发明发现，聚唾液酸与安罗替尼的质量比对于静电复合物的粒径和粒子分散系数影响较大，当控制在上述比例范围内时，制得的静电复合物的粒径较小，且粒径分布较为均一，稳定性较高。

62、在一些实施方案中，所述安罗替尼或其药学上可接受的盐溶液的浓度为1～10mg/ml。

63、更优选地，所述安罗替尼或其药学上可接受的盐溶液的浓度为3～5mg/ml，所述聚唾液酸溶液的浓度为15～25mg/ml。

64、优选地，所述混合的温度为25～35℃，和/或所述混合的时间为10～20min。

65、在上述条件下，聚唾液酸修饰的安罗替尼静电复合物的复合率更佳。

66、在一些实施方案中，所述聚唾液酸或安罗替尼或其药学上可接受的盐采用灭菌注射用水溶解或采用葡萄糖溶液溶解。

67、进一步，本发明提供了一种药物组合物，其中含有上述任一实施方案中所述的唾液酸衍生物修饰的安罗替尼脂质体或聚唾液酸修饰的安罗替尼静电复合物。

68、在一些实施方案中，所述药物组合物还包括药学上可接受的赋形剂(例如药学上可接受的抗氧剂、稀释剂、粘合剂等)。

69、在一些实施方案中，所述药物组合物的剂型包括但不限于临床上可接受的片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、软膏剂、口服液剂、输液剂、注射剂等制剂。

70、在一些实施方案中，所述药物组合物中还包括等渗调节剂和/或冻干保护剂。

71、在一些实施方案中，所述等渗调节剂为葡萄糖、海藻糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、甘油、氯化钠中的至少一种；所述冻干保护剂为葡萄糖、甘露醇、海藻糖、山梨醇、蔗糖、乳糖、麦芽糖、右旋糖酐中的至少一种。

72、进一步，本发明提供了上述任一实施方案中所述的唾液酸衍生物修饰的安罗替尼脂质体、所述的聚唾液酸修饰的安罗替尼静电复合物、或所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

73、本发明的两种安罗替尼纳米制剂，以唾液酸和聚唾液酸为靶头，基于“mps通路”和sa受配体介导作用，借助tams补充和更新过程中单核细胞的招募通路将药物递送至肿瘤组织，同时抑制肿瘤血管内皮细胞、杀伤肿瘤细胞和耗竭tams，修剪不成熟的肿瘤血管，实现肿瘤血管正常化，进而利用正常化血管促进免疫细胞浸润，推动肿瘤免疫循环正常运行，缓解tme免疫抑制特性，实现良好的抗肿瘤效果。

74、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

75、本发明制备了两种安罗替尼纳米制剂，改善了现有安罗替尼口服胶囊剂的生物利用度，提高了安罗替尼的抗肿瘤疗效并且降低了安罗替尼的毒副作用，展现出了良好的体内外靶向能力和抗肿瘤效果，该纳米制剂重现性高，便于工业化生产。