具有经修饰的AAV衣壳多肽的重组腺相关病毒的制作方法

本发明涉及基因治疗。特别地，本发明涉及经修饰的腺相关病毒(aav)衣壳多肽以及包含所述经修饰的aav衣壳多肽的新的重组腺相关病毒(raav)，其用于递送用于治疗的基因产物。

背景技术：

1、基因治疗最近受到越来越多的关注。改进的基因转移技术为基因治疗的发展提供了极大的帮助。

2、基因治疗最初涉及将外源基因引入患者细胞，以纠正先天性遗传错误，如功能丧失突变。目前批准的大多数基因治疗方案涉及将患者体内有缺陷的基因的功能性拷贝引入患者的体细胞。但最近，基因治疗广泛定义为通过将新的遗传信息引入有需要的生物体来纠正疾病表型。

3、在体内基因治疗中，转移的基因(转基因)原位引入受体生物体的器官、组织和细胞，如肌肉造血干细胞、动脉壁、神经系统、肺和眼睛。

4、通过将转基因原位引入眼睛的体内基因治疗已用于治疗眼部疾病(如导致失明的疾病)。此类疾病的实例包括视网膜色素变性、黄斑病变、leber先天性黑朦、lieber遗传性视神经病变、早发性严重视网膜营养不良、全色盲、视网膜睑裂病、眼部白化病、眼白化病、青光眼、stargardt病、无脉络膜、年龄相关性黄斑变性(amd，包括湿性amd)、脊髓小脑共济失调7型(scat)、色盲和影响角膜的溶酶体储存疾病(如粘多糖沉积症(mps)iv和mps vii)。

5、腺相关病毒(aav)是细小病毒科的成员。它是一种简单的单链dna病毒，需要辅助病毒(如腺病毒)进行复制。野生型aav的基因组包含约4.7千碱基(kb)，包括两个反向末端重复(itr)序列之间的cap和rep基因，其具有中断的回文序列，可以折叠成发夹结构，在dna复制启动过程中充当引物。cap基因编码病毒衣壳蛋白，而rep基因参与aav的复制和整合。aav可以感染多种细胞，并且在rep产物的存在下，病毒dna可以整合到人19号染色体中。

6、临床开发中的raav基因治疗很大一部分集中在cns，包括脑和眼睛。目前有十几种的衣壳血清型用作临床试验的载体，其中数量最多的是基于aav2的眼部疾病平台。值得注意的是，美国食品和药物管理局(fda)批准的第一种raav基因治疗药物luxturna使用aav2治疗由rpe65基因突变引起的遗传性视力丧失患者。然而，越来越需要更新的改良和更有效的衣壳。

7、设计新型aav衣壳以获得新的特性和特征一直是不断追求的目标。合理设计方法的一个主要局限性与关于aav细胞表面结合、内化、运输、脱壳和基因表达的知识不足有关。

8、已经开发了几种经修饰的aav衣壳(参见例如wo2012145601a2、wo2016134375a1和wo2018022905a2)，然而，仍然需要开发新的修饰aav衣帽来改善眼部疾病的基因治疗，例如用于原位递送编码治疗疾病的产品的多核苷酸的基因治疗。

技术实现思路

1、在第一方面，本发明涉及一种经修饰的aav衣壳多肽，与亲本aav衣壳多肽相比，其包含插入环iv的肽，并且其中所述插入的肽包含式i所示的氨基酸序列：

2、间隔子1-x1-x2-x3-x4-x5-x6-x7-间隔子2(i)

3、其中

4、x1选自g、l和n；

5、x2选自k、a、g和s；

6、x3选自g、e和p；

7、x4选自p和t；

8、x5选自t、s和g；

9、x6选自t、r和k；并且

10、x7选自k、p和n。

11、本发明还提供编码本发明的经修饰的aav衣壳多肽的多核苷酸，包含所述多核苷酸的载体以及包含所述多核苷酸或载体的宿主细胞。

12、在第二方面，本发明提供一种用于包装raav的系统或试剂盒，其包含本发明的多核苷酸、载体或宿主细胞。

13、在第三方面，本发明提供一种重组腺相关病毒(raav)，其包含本发明的经修饰的aav衣壳多肽以及编码基因产物的基因组。

14、在第四方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本发明的raav。

15、本发明提供一种治疗视网膜疾病的方法，其包括向有需要的受试者的眼睛给药本发明的raav或药物组合物。

16、本发明提供raav或药物组合物，用于治疗视网膜疾病。

17、本发明提供本发明的raav或药物组合物在制备用于治疗视网膜疾病的药物中的用途。

技术特征：

1.一种经修饰的腺相关病毒(aav)衣壳多肽，与亲本aav衣壳多肽相比，其包含插入环iv的肽，并且其中所述插入的肽包含式i所示的氨基酸序列：

2.权利要求1的经修饰的aav衣壳多肽，其中所述插入的肽包含式ii所示的氨基酸序列：

3.权利要求1或2的经修饰的aav衣壳多肽，其中x1-x2-x3-x4-x5-x6-x7为选自seq idno:6(gkgpttk)、seq id no:7(laepsrp)、seq id no:8(lgppskp)和seq id no:9(nsptgrn)的氨基酸序列。

4.权利要求1的经修饰的aav衣壳多肽，其中所插入的肽包含选自seq id no:10(aaagkgpttkaa)、seq id no:11(aaalaepsrpaa)、seq id no:12(alalgppskpaa)和seq idno:13(aagnsptgrnaa)的氨基酸序列。

5.权利要求1-4中任一项的经修饰的aav衣壳多肽，其中所述亲本aav衣壳多肽为包含以下氨基酸序列的aav2衣壳多肽：seq id no:1、seq id no:1的氨基酸138-735或seq idno:1的氨基酸203-735，或其变体，所述变体与seq id no:1的全长、氨基酸138-735或氨基酸203-735至少90％相同。

6.权利要求1-5中任一项的经修饰的aav衣壳多肽，其中所述肽插入在对应于seq idno:1的位置587和588的位置之间。

7.权利要求1-6中任一项的经修饰的aav衣壳多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：seqid no:2、3、4和5，seq id no:2、3、4或5的氨基酸138-747，seq id no:2、3、4或5的氨基酸203-747。

8.一种多核苷酸，其编码权利要求1-7中任一项的经修饰的aav衣壳多肽。

9.一种载体，其包含权利要求8的多核苷酸。

10.一种宿主细胞，其包含权利要求8的多核苷酸或者权利要求9的载体。

11.一种用于包装raav的系统或试剂盒，其包含权利要求8的多核苷酸、权利要求9的载体或权利要求10的宿主细胞。

12.一种重组腺相关病毒(raav)，其包含经修饰的aav衣壳多肽和编码基因产物的基因组，其中与亲本aav衣壳多肽相比，所述经修饰的aav衣壳多肽包含插入环iv的肽，并且其中所述插入的肽包含式i所示的氨基酸序列：

13.权利要求12的raav，其中所述插入的肽包含式ii所示的氨基酸序列：

14.权利要求12或13的raav，其中x1-x2-x3-x4-x5-x6-x7为选自seq id no:6(gkgpttk)、seq id no:7(laepsrp)、seq id no:8(lgppskp)和seq id no:9(nsptgrn)的氨基酸序列。

15.权利要求12的raav，其中所述插入的肽包含选自seq id no:10(aaagkgpttkaa)、seq id no:11(aaalaepsrpaa)、seq id no:12(alalgppskpaa)和seq id no:13(aagnsptgrnaa)的氨基酸序列。

16.权利要求12-15中任一项的raav，其中所述亲本aav衣壳多肽为包含以下氨基酸序列的aav2衣壳多肽：seq id no:1、seq id no:1的氨基酸138-735或seq id no:1的氨基酸203-735，或其变体，所述变体与seq id no:1的全长、氨基酸138-735或氨基酸203-735至少90％相同。

17.权利要求12-16中任一项的raav，其中所述肽插入在对应于seq id no:1的位置587和588的位置之间。

18.权利要求12-17中任一项的raav，其中所述经修饰的aav衣壳多肽包含选自seq idno:2、3、4和5，seq id no:2、3、4或5的氨基酸138-747，seq id no:2、3、4或5的氨基酸203-747的氨基酸序列。

19.一种药物组合物，其包含权利要求12-18中任一项的raav。

20.一种治疗视网膜疾病的方法，其包括向有需要的受试者的眼睛给药权利要求12-18中任一项的raav或权利要求19的药物组合物。

21.权利要求12-18中任一项的raav或权利要求19的药物组合物，用于治疗视网膜疾病。

22.权利要求12-18中任一项的raav或权利要求19的药物组合物在制备用于治疗视网膜疾病的药物中的用途。

技术总结本发明涉及一种经修饰的腺相关病毒(AAV)衣壳多肽以及一种新的重组腺相关病毒(rAAV)，其包含所述经修饰的AAV衣壳多肽，用于递送用于疗法的基因产物。本发明还涉及一种包含本发明的rAAV的药物组合物以及一种治疗视网膜疾病的方法，其包括向有需要的受试者的眼睛给药本发明的rAAV或药物组合物。技术研发人员：Y·舒,J·侯,H·李,任琼琼,肖路梅,伍兵,李佩璐受保护的技术使用者：九天生物医药（上海）有限公司技术研发日：技术公布日：2024/9/29