HIV特异性结合分子和TCR的制作方法

背景技术：

1、人类免疫缺陷病毒(hiv)是获得性免疫缺陷综合征(aids)的病原体。该病毒是一种有包膜的逆转录病毒，属于慢病毒组。据估计，2020年全球约有4000万成人和儿童感染hiv(aids by the numbers.unaids.2020；accessed june 29,2021年6月29日生效。https://www.unaids.org)。目前的治疗依赖于使用联合抗逆转录病毒疗法(art)来控制病毒感染。然而，尽管这些治疗方法有效，但它们无法完全根除感染，因为病毒基因稳定地整合到宿主细胞染色体中，导致迅速建立一个长寿且潜伏感染的cd4+t细胞库(siliciano等，2003nat med,9,727)。病毒反弹通常发生在治疗停止后，这意味着需要终生治疗。大多数hiv感染者在感染过程中都会对hiv gag蛋白产生强烈的t细胞反应，但这些t细胞无法消除携带有复制能力的原病毒的长寿cd4+t细胞。迄今为止，已测试的免疫治疗策略在治疗后控制和/或减少hiv病毒库方面尚未产生有意义的临床益处(ward ar等，seminimmunol.2020:101412；barr l等，journal of virus eradication.2020；6:100010)。因此，需要有可能根除病毒库并实现功能性治愈的新的治疗方法。

2、一种新型免疫治疗方法涉及使用工程化t细胞受体(tcr)以产生针对hiv感染细胞的强效免疫反应。在自然界中，t细胞和tcr对抗原的亲和力通常较弱，在低微摩尔至纳摩尔范围内。通过突变抗原识别位点对tcr进行工程化可以提高抗原亲和力，从而导致体内免疫反应增强。在hiv的背景下，增强的反应应该足以从低水平抗原表达的病毒库中消灭具有复制能力的病毒。这类工程化tcr可用于使用基因修饰t细胞的细胞治疗应用(参见vonderheide and june,2014,immunol rev,257,7-13)。或者，可以将工程化的tcr生产为可溶性试剂，以便将细胞毒性或免疫刺激剂递送至受感染的细胞(lissin等，(2013).“high-affinity monocloncal t-cell receptor(mtcr)fusions.fusion proteintechnologies for biophamaceuticals:applications and challenges”.s.r.schmidt,wiley；boulter等，(2003),protein eng 16(9):707-711；liddy等，(2012),nat med 8:980-987；wo03/020763)。已经成功开发出类似的方法用于治疗某些癌症(nathan,p等，newengl j med 385,1196–1206(2021))。

3、对于用作治疗剂的可溶性tcr，希望其对抗原的亲和力(kd)和/或结合半衰期特别高，例如皮摩尔范围内的kd和/或几个小时的结合半衰期。这种高亲和力是驱动针对呈现低水平抗原的靶细胞的强效反应所必需的。在所有涉及亲和力工程化的tcr的应用中，tcr不仅要比相应的野生型tcr对抗原具有更高的亲和力，而且还要保留高水平的抗原特异性，这一点至关重要。在这种情况下，当这类tcr被施用于患者时，特异性的丧失可能会导致脱靶效应。

4、亲和力成熟通常需要技术人员识别特定突变和/或突变组合，其包括但不限于可对wt tcr序列进行的取代、插入和/或缺失，以增加抗原识别强度。本领域已知识别赋予亲和力增强的特定tcr突变的方法，例如使用展示文库(li等，(2005)nat biotechnol.23(3):349–354；holler等，(2000).proc natl acad sci u s a；97(10):5387–5392)。然而，为了显著增加特定tcr对特定靶标的亲和力，技术人员需要从大量可能的替代方案中选择特定突变和/或突变组合。在多数情况下，可能无法实现所需的亲和力和特异性。高亲和力和高特异性所需的突变还应产生能够以合理产量表达、重折叠和纯化并且在纯化形式下高度稳定的tcr。

5、肽序列slyntvatl(seq id no:1)来源于gag基因的p17基因产物，gag基因是构成hiv病毒的九个基因之一，并且已证实t细胞反应在控制病毒载量方面特别有效，这表明该表位是免疫显性的(rolland等，2008,plos one,3:e1424；streeck h等，j virol.2009；83(15):7641-7648；pereyra等，j virol.2014；88(22):12937-12948)。该肽(本文称为gag)由hla-a*02呈递在hiv感染细胞的表面上。尽管频率较低，但在接受art治疗(无病毒血症)的个体中也检测到了gag特异性t细胞(gray cm等，j immunol.1999；162(3):1780-1788；ogggs等，j virol.1999；73(1):797-800；seth a等，j infect dis.2001；183(5):722-729)。因此，gag-hla-a*02复合物为基于tcr的hiv感染细胞的识别提供了理想的靶点。

6、wo2017163064公开了相对于识别gag-hla-a*02复合物的wt tcr已发生突变的tcr。用所述亲和力增强的tcr转导的cd8+细胞毒性t细胞能够在适合t细胞疗法的效应靶比下体外控制hiv感染。这些tcr能够识别所有最常见的病毒逃逸肽(varela-rohena等，2008,nat med,14(12):1390-5)。这类tcr可用于过继性t细胞疗法以及基于可溶性tcr的疗法。此外，yang等人描述的体内研究表明，并入wo2017163064中公开的tcr的双特异性分子可以通过重定向多克隆(非hiv特异性)cd8+t细胞消除art治疗个体中hiv感染的cd4+t细胞，绕过可能变得功能失调的hiv特异性免疫效应物(yang h等，mol ther.2016；24(11):1913-1925)。

7、发明人已经发现，wo2017163064中公开的tcr的某些突变可以令人预料不到地增加大肠杆菌生产过程中的产量和/或稳定性，且不会影响靶标结合。这类分子具有临床开发的理想特性。

技术实现思路

1、本发明涉及特异性结合分子，例如t细胞受体(tcr)，其结合来源于hiv gag基因产物p17的hla-a*02限制肽slyntvatl(seq id no:1)。所述特异性结合分子可包含嵌入在框架序列内的cdr序列。cdr和框架序列可对应于t细胞受体(tcr)可变结构域，并且可进一步包含相对于天然tcr可变结构域的非天然突变。本发明的特异性结合分子具有改善的稳定性和/或产量，并且令人预料不到地保留了它们所来源的特异性结合分子的有利特性(对seq id no:1和hla-a*02的复合物具有高亲和力、特异性和灵敏度，并驱动特别有效的t细胞反应)。这类特异性结合分子在开发用于治疗hiv感染个体的可溶性免疫治疗试剂方面特别有用。

2、本文公开了特异性结合分子，其具有结合与hla-a*02复合的slyntvatl(seq idno:1)的特性，并且包含tcrα链可变结构域和tcrβ链可变结构域，其中所述α链可变结构域包含选自以下的氨基酸序列：

3、(a)

4、

5、(b)

6、

7、或

8、(c)

9、

10、任选地具有n端甲硫氨酸(seq id no:41-43)，和

11、所述β链可变结构域包含以下氨基酸序列：

12、

13、任选地具有n端甲硫氨酸(seq id no:44)。

14、在一些实施方案中，特异性结合分子具有结合与hla-a*02复合的slyntvatl(seqid no:1)的特性，并且包含tcrα链可变结构域和tcrβ链可变结构域，其中所述α链可变结构域具有选自以下的氨基酸序列：

15、(a)

16、

17、(b)

18、

19、或

20、(c)

21、

22、任选地具有n端甲硫氨酸(seq id no:41-43)，和/或

23、所述β链可变结构域具有以下氨基酸序列：

24、

25、

26、任选地具有n端甲硫氨酸：

27、

28、在另一个方面，本文公开了编码tcrα链和/或tcrβ链的核酸分子，其中所述tcrα链包含选自以下的可变结构域氨基酸序列：

29、(a)

30、

31、(b)

32、

33、或

34、(c)

35、

36、任选地具有n端甲硫氨酸(seq id no:41-43)，和/或

37、所述tcrβ链包含可变结构域氨基酸序列：

38、

39、任选地具有n端甲硫氨酸(seq id no:44)。

40、在一些实施方案中，核酸分子编码tcrα链和/或tcrβ链，其中所述tcrα链具有选自以下的可变结构域氨基酸序列：

41、(a)

42、

43、(b)

44、

45、或

46、(c)

47、任选地具有n端甲硫氨酸(seq id no:41-43)，和/或

48、所述tcrβ链具有可变结构域氨基酸序列：

49、

50、任选地具有n端甲硫氨酸(seq id no:44)。

51、在另一个方面，本文公开了药物组合物，其包含特异性结合分子，所述特异性结合分子具有结合与hla-a*02复合的slyntvatl(seq id no:1)的特性，并且包含tcrα链可变结构域和tcrβ链可变结构域，其中所述α链可变结构域氨基酸序列包含选自以下的氨基酸序列：

52、(a)

53、

54、(b)

55、

56、或

57、(c)

58、

59、任选地具有n端甲硫氨酸(seq id no:41-43)，以及

60、所述β链可变结构域包含以下氨基酸序列：

61、

62、任选地具有n端甲硫氨酸(seq id no:44)。

63、在一些实施方案中，药物组合物包含tcrα链可变结构域和tcrβ链可变结构域，其中所述α链可变结构域具有tcrα链可变结构域和tcrβ链可变结构域，其中所述α链可变结构域具有选自以下的氨基酸序列：

64、(a)

65、

66、(b)

67、

68、或

69、(c)

70、

71、

72、任选地具有n端甲硫氨酸(seq id no:41-43)，和

73、所述β链可变结构域具有以下氨基酸序列：

74、

75、任选地具有n端甲硫氨酸(seq id no:44)。

76、本文还公开了在人类受试者中治疗hiv感染或aids的方法，其包括施用治疗有效量的特异性结合分子，所述特异性结合分子具有结合与hla-a*02复合的slyntvatl(seq idno:1)的特性，并且包含tcrα链可变结构域和tcrβ链可变结构域，其中所述α链可变结构域包含选自以下的氨基酸序列：

77、(a)

78、

79、(b)

80、

81、或

82、(c)

83、

84、任选地具有n端甲硫氨酸(seq id no:41-43)，和

85、所述β链可变结构域包含以下氨基酸序列：

86、

87、

88、任选地具有n端甲硫氨酸(seq id no:44)。

89、在一些实施方案中，该方法包括施用治疗有效量的特异性结合分子，该特异性结合分子具有结合与hla-a*02复合的slyntvatl(seq id no:1)的特性，并且包含tcrα链可变结构域和tcrβ链可变结构域，其中所述α链可变结构域具有选自以下的氨基酸序列：

90、(a)

91、

92、(b)

93、

94、或

95、(c)

96、

97、任选地具有n端甲硫氨酸(seq id no:41-43)，和

98、所述β链可变结构域具有以下氨基酸序列：

99、

100、任选地具有n端甲硫氨酸(seq id no:44)。

101、在另一个方面，本文公开了包含细胞，其包含：(a)tcr表达载体，其包含在单个开放阅读框中的本文公开的核酸，或分别编码所述α链和所述β链的两个不同的开放阅读框；或(b)第一表达载体，其包含编码本文公开的tcr的α链的核酸，以及第二表达载体，其包含编码本文公开的tcr的β链的核酸。

102、在又一个方面，本文公开了分离的或非天然存在的细胞，特别是递呈本文公开的tcr的t细胞。