用于抑制细胞中MASP-2表达的核酸的制作方法

本发明关于干扰或抑制甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2(mannan-bindinglectin serine protease 2，masp-2)基因表达的双链核酸分子。其进一步关于此类抑制的治疗用途，诸如用于治疗与体内补体路径，尤其凝集素路径失调和/或masp-2的过度活化或异位表达或定位或积聚相关的疾病及病症。

背景技术：

1、双链rna(dsrna)能够经由互补碱基配对与所表达的mrna结合，已表明其可藉由一种被称为“rna干扰(rnai)”的机制阻断基因表达(fire等人,1998,nature.1998年2月19日；391(6669):806-11及elbashir等人,2001,nature.2001年5月24日；411(6836):494-8)。短dsrna在许多生物体(包括脊椎动物)中引导基因特异性的转录后沉默，且已成为用于研究基因功能的适用工具。rnai由rna诱导的沉默复合体(rna induced silencing complex，risc)，一种降解信使rna的序列特异性多组分核酸酶介导，该等信使rna与负载至risc复合体中的沉默触发子(trigger)充分互补或同源。诸如sirna、反义rna及微小rna的干扰rna为寡核苷酸，其藉由基因沉默来阻止蛋白形成，亦即经由降解mrna分子来抑制蛋白的基因转译。基因沉默剂对于医学中的治疗应用变得愈来愈重要。

2、根据watts及corey在journal of pathology(2012；第226卷，第365-379页)中所说，有算法可以用于设计核酸沉默触发子，但所有此等算法均有严重的局限性。可能需要各种实验方法来识别强效sirna，因为算法不考虑诸如目标mrna的三级结构或rna结合蛋白的参与等因素。因此，发现具有最小脱靶效应的强效核酸沉默触发子是一个复杂的过程。为了此等高度带电分子的医药开发，有必要使其可以经济地合成，分布于目标组织，进入细胞且在可接受的毒性限值内发挥作用。

3、补体系统或路径为宿主防御侵入病原体的先天免疫系统的一部分。其主要由血流中许多以前驱体形式循环的蛋白组成。形成补体系统的大部分蛋白，包括补体组分蛋白c3(在本文中亦简称为c3)，主要由肝中的肝细胞合成且分泌至血流中。系统活化引起发炎反应，产生吞噬细胞吸引及调理吞噬作用(opsonization)，且因此导致病原体、免疫复合体及细胞碎片的清除(janeway'simmunobiology第9版)。补体系统由3条路径(经典、凝集素及替代路径)组成，其均汇聚于形成所谓补体组分3转化酶复合体。此等酶复合体使补体组分c3蛋白裂解成c3a及c3b。一旦裂解，c3b形成复合体的一部分，该复合体又将c5裂解成c5a及c5b。在裂解之后，c5b为主要补体路径效应子，亦即膜攻击复合体的关键组分之一。因此，c3为补体系统活化路径的关键组分。

4、补体因子b(cfb或“因子b”)参与替代路径的活化。cfb与c3b的结合(例如在细胞表面上)使得cfb对因子d裂解敏感，形成丝氨酸蛋白酶c3bb，该蛋白酶自身为c3转化酶，引起用于c3活化的放大环路(amplification loop)。cfb主要在肝中合成且在若干肝外部位以低水平合成。

5、甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2(亦称为甘露糖结合蛋白相关丝氨酸蛋白酶2，或称为甘露聚糖结合凝集素丝氨酸肽酶2或mbl相关丝氨酸蛋白酶2)(masp-2)基因编码蛋白masp-2，该基因参与补体系统的凝集素路径活化的主要酶。masp-2亦可经由藉由未知机制引起c3的masp-2-依赖性活化的c4/c2旁路途径来活化补体系统的替代路径。masp-2基因编码丝氨酸蛋白酶的肽酶s1家族的成员。将经编码的前蛋白以蛋白分解方式处理以产生杂二聚形成成熟蛋白酶的a及b链。此蛋白酶使补体组分c2及c4裂解以在补体系统的凝集素路径中产生c3转化酶。经编码的蛋白酶亦经由裂解凝血酶原形成凝血酶而在凝血级联中起作用。选择式剪接产生多种转录物变体，其中至少一种编码以蛋白分解方式处理的同种型。

6、masp-2基因编码76kda丝氨酸蛋白酶masp-2(长同种型)，其在肝中高度表达；及19kda选择式剪接产物map19(短同种型)，其存在于血浆中。

7、若干疾病与补体路径的异常获得性或遗传活化以及masp-2的异常或过度表达相关。

8、当前仅存在极少的针对补体系统介导的疾病、病症及综合征的治疗。单株人源化抗体艾库组单抗(eculizumab)为其中之一。已知其结合补体蛋白c5，由此在补体级联结束时阻断膜攻击复合体(hillmen等人,2006nejm)。然而，仅一小类患有补体系统介导的疾病的患者对艾库组单抗疗法起反应。因此，存在对医学治疗补体介导或相关的疾病的高度未满足的需求。抑制masp-2表达为许多补体介导的疾病提供有前景的治疗策略。已提出，将例如经由反义寡核苷酸或抑制剂靶向masp-2表达或活性作为各种补体介导的病状的潜在治疗策略，该等病状包括：类风湿性关节炎(holers等人,front immunol.2020年2月21日；11:201)、iga肾病变、狼疮性肾炎(lafayette等人,kidney int rep.2020年8月13日；5(11):2032-2041)、血栓性微血管病及非典型性溶血性尿毒性综合征(elhadad等人,clin expimmunol.2021年1月；203(1):96-104；young等人,bone marrow transplant.2021年8月；56(8):1805-1817)。已建议研究masp-2抑制(经由抗体)以治疗肺炎球菌脑膜炎(kasanmoentalib等人,jneuroinflammation.2017年4月6日；14(1):77)及冠状病毒感染(flude等人,viruses,2021年2月17日；13(2):312)。

9、wo2012139081a2，lafayette等人(kidney int rep.2020年8月13日；5(11):2032-2041)、young等人(bone marrow transplant.2021年8月；56(8):1805-1817及elhadad等人(clin exp immunol.2021年1月；203(1):96-104)描述用于治疗具有masp-2依赖性补体活化的病状的masp-2抗体(例如，纳索利单抗(narsoplimab))。us20200032270a1及wo2021168148a1描述靶向masp-2基因的双链rna药剂。

技术实现思路

1、本发明的一个方面为用于抑制甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2(masp-2)的表达的双链核酸，其中核酸包含第一链及第二链，其中第一链序列的未经修饰的等效物包含至少15个核苷酸的序列，其与表5a中所示的第一链序列中的任一者相差不超过3个核苷酸。

2、第一链序列的未经修饰的等效物可例如包含至少15个核苷酸的序列，其与表1中所列的第一链序列中的任一者相差不超过3个核苷酸。

3、因此，本文所描述的核酸能够优选在细胞中抑制masp-2表达的双链核酸，且可例如在相关诊断或治疗方法中用作治疗剂或诊断剂。核酸包含第一链及第二链或由其组成，且第一链典型地包含与masp-2mrna充分互补的序列，从而介导rna干扰。

4、一个方面关于一种组合物，其包含如本文所揭示的核酸、及溶剂(优选水)、和/或递送媒剂、和/或生理学上可接受的赋形剂、和/或载剂、和/或盐、和/或稀释剂、和/或缓冲剂、和/或防腐剂。

5、一个方面关于一种组合物，其包含如本文所揭示的核酸及另一治疗剂，该治疗剂选自例如寡核苷酸、小分子、单克隆抗体、多克隆抗体及肽。

6、一个方面关于一种如本文所揭示的核酸或包含该核酸的组合物，其用作例如相关方法中的治疗剂或诊断剂。

7、一个方面关于一种如本文所揭示的核酸或包含该核酸的组合物，其用于预防或治疗疾病、病症或综合征。

8、一个方面关于一种如本文所揭示的核酸或包含该核酸的组合物在预防或治疗疾病、病症或综合征中的用途。

9、一个方面关于一种如本文所揭示的核酸或包含该核酸的组合物的用途，其用于制备用以预防或治疗疾病、病症或综合征的药剂。

10、一个方面关于一种预防或治疗疾病、病症或综合征的方法，其包含向需要治疗的个体施用医药学上有效剂量或量的如本文所揭示的核酸或包含该核酸的组合物，优选地其中该核酸或组合物经皮下、静脉内或经口、经直肠、经肺、肌肉内或腹膜内施用来向个体施用。