一种纯化多肽的方法与流程

本发明涉及一种纯化多肽的方法的，特别涉及一种纯化多肽的高效液相色谱方法。

背景技术：

1、多肽分子，特别是分子量较大的多肽（2000d以上），由于杂质分子与目标分子的结构和性质的相似度较高，分离纯化难度较大；并且多肽类药物以注射剂为主，单杂通常需要控制在0.1%以下。基于多肽的上述特性，多肽色谱纯化通常上样量低，造成高成本；对于纯化条件的稳定性和精密性要求高，以保证达到精准的分离。在设备上需要更高的自动化和更加精密的控制，以提高效率以及高纯度合格产品的收率。另一方面，特别对于分子量较大的多肽（2000d以上），不仅目标物与结构、组成相近的杂质难以分离，而且这类多肽更容易在色谱柱上形成严重的拖尾，此外如果多肽是用发酵法制备而来的，在进行色谱分离的粗品中常会含有少量蛋白，而这些蛋白会在色谱填料上吸附并且变性，最终只能用碱性水溶液对柱子中的色谱填料进行清洗，才能恢复分离效果。综上分析，针对大分子量多肽，填料上需要提供具有更高选择性，更高上样量，降低拖尾（吸附损失）并且耐压和耐腐蚀的材料，以提高效率、提高收率，降低综合成本；因此，在多肽药的开发和生产中，亟需新的色谱纯化解决方案，从设备、填料和方法多方面实现创新，提高更为高效率、高稳定性的多肽纯化方法，特别是分子量在2000d以上的多肽的色谱纯化。

2、本领域技术人员普遍知晓，对于较高分子量的多肽（2000d以上），比如胰岛素，司美格鲁肽等，粗产品中含有大量分子量和结构非常相近的杂质，难以分离；并且这些多肽分子在不同的条件下会形成不同的三维形态（如离子对多聚体，纳米球状），硅胶中不规则的微孔不仅对于这类较大的分子没有分离的贡献，而且会造成拖尾甚至死吸附等负面影响；因此选择一类具有合适的硅胶结构的色谱填料对于分离纯化较大分子量的多肽有至关重要的影响。

3、胰岛素、利拉鲁肽这类多肽的分子量为5000d左右，5000d分子量的化合物的长度接近500å，在色谱分离的过程中，10%为极限孔，即为50å，低于50å的孔径就不能实现色谱分离，会形成死孔；考虑到c8/c18键合相的影响造成有效孔体积和直径减少，内径约减少15-20å。因此定义为7nm，也就是70å以下微孔含量影响了多肽化合物的纯化分离回收率。进一步，更小的孔（<40 å）不仅对于多肽没有分离效用，还会造成更严重的拖尾，并且降低填料耐压和耐碱水腐蚀的能力。

4、另一方面，许多大分子量多肽采用生物法制造，因此在进行色谱纯化时会在色谱填料表面形成蛋白纤维沉积，从而需要经常用氢氧化钠溶液对色谱填料进行清洗，因此需要提高填料的机械强度和耐碱性。

5、本领域技术人员普遍知晓，小颗粒可增加塔板数及分辨率，但同时引起装柱困难，需要更高的操作压力；同时还会形成高的柱压降，柱压降增大会使流动相经过色谱柱时产生更多的摩擦热，而摩擦热是造成色谱柱不稳定的重要因素。并且，摩擦热在大直径的色谱柱中热量难以扩散，所以减少摩擦热效应对大直径色谱柱非常重要。

6、通过优化分离材料和研发一种智能、精密和高效的液相色谱纯化系统以及所对应的纯化方法，以达到提高分离效果，提高效率，降低纯化成本；并且降低生产质量风险和损失，对于多肽原料等高纯度、高价值产品的生产有着非常重要的实用意义。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种纯化多肽，尤其是分子量介于2000-6000d的多肽，的方法。为实现上述目的，本发明采取的技术手段：

2、一种纯化多肽的方法，采用高精度的高效制备液相色谱系统，该系统配置有控制装置、轴向加压液相色谱柱、洗脱剂输送系统、上样装置、在线检测装置、馏分自动收集系统；

3、控制装置由远程控制中心和控制柜组成，实现数据传输和电控制；远程控制中心与控制柜实现通讯连接，与控制柜实现数据传输和指令传递；控制柜采用正压防爆，以保证控制系统各装置操作的和数据传输的电器件的防爆。

4、洗脱剂输送系统由溶剂储存罐、输液泵、混合器以及电程控阀门、流量计等组成；可以采用一个或两个精密恒流泵，泵的流量误差需在1.5%以内；流量计数据可以即时发聩给控制系统，以便即时调整流量，进一步保证流量的精确度；控制系统还可以依据事先设定的梯度程序，控制两个泵的流量以实现各种梯度洗脱模式。

5、上样装置可以由样品溶液储罐和上样泵组成，配有相应的控制阀门，还可以选配流量计以便精准定量进样。上样装置还可以配备有手动进样阀门，以便必要时手动加入样品或试剂。上样还可以通过控制系统采用对进样泵、输液泵及柱前的切换阀实行联动控制，实现样品和洗脱剂的快速交替进入。该方法可以用于：1-减少样品溶液在色谱柱中的扩散；2-实现样品的同柱多段分离，以大幅度提高效率。上样装置还进一步包含一个装填有大粒径色谱填料（20um-100um）的短柱，该短柱介于轴向加压柱和进样泵之间，短柱的前端和后端都有多通道切换阀，切换阀与控制装置有数据传输和电控制线连接，由控制软件经控制装置来控制。

6、色谱柱填料为球形介孔硅胶基质反相色谱填料，柱子填充高度为20-100厘米，优选的，20-80厘米；填料中除硅元素外其它金属总含量不超过100ug/g，平均孔径范围为90å-150å，孔隙率为0.8-1.0cm3/g，比表面积为280-380m2/g，平均粒径范围为5微米-30微米；孔径范围在70å以下的微孔占比小于15%，40å以下的微孔占比小于5%；分离用的洗脱剂为水溶液，水溶液含有水溶性的酸、碱或盐，或可以溶于水的有机溶剂。

7、进一步的，色谱填料表面嵌入极性基团，杂化修饰。

8、进一步的，极性基团选用极性含氮基团和/或羧基；所述极性含氮基团包括氨基、胺基、酰胺基、氨基碳酸脂，脲基；更具体的如：氨丙基二甲基硅氧基、氨乙基二甲基硅氧基、十二烷基酰胺基乙基二甲基硅氧基等。

9、色谱填料的硅胶基球表面（包括孔内的表面）通过杂化修饰，提高填料的耐碱和耐盐性能，杂化可以通过涂敷含有乙撑基六甲氧基硅烷与四乙氧基或四甲氧基硅烷的混合水解物来实现。

10、进一步的，色谱填料可以通过键合有2种以上硅烷基来改善结构相近的化合物的分离效果。这里所说的2种以上硅烷基键合不包括封尾，可以同时键合、也可以分步键合；其中不含极性基团的硅烷基含有不少于5个碳原子，且其中含量最低的硅烷基比例不低于10%。

11、进一步的，硅烷基指含有极性基团的和不含有极性基团的烷基硅氧基，所述硅氧基包括极性基团修饰的硅氧基；

12、还包括：十八烷基二甲基硅氧基、十八烷基二异丙基硅氧基、十八烷基二异丁基硅氧基、十六烷基二甲基硅氧基、十二烷基二甲基硅氧基、癸烷基二甲基硅氧基、辛基二甲基硅氧基、己基二甲基硅氧基、丁基二甲基硅氧基、丙基二甲基硅氧基、异丙基二甲基硅氧基、异丁基二甲基硅氧基、氨丙基二甲基硅氧基、氨乙基二甲基硅氧基。

13、进一步的，水溶液的ph在1-12之间，添加的酸、碱或盐包括三氟乙酸、醋酸、磷酸、柠檬酸、醋酸钠、磷酸钠、磷酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、柠檬酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢胺、醋酸胺、磷酸二氢胺、磷酸氢二铵、三乙胺、碳酸三乙胺、醋酸三乙胺。

14、进一步的，高精度质量流量计实时精准监测流量，并反馈给控制柜；控制柜即时调整流量至设定值，从而保障流量精度；并且用高精度质量流量计实时监测回收的溶剂密度，并反馈给控制柜，控制柜根据回收溶剂的密度，控制溶剂罐加入所需体积的相应溶剂，使混合后的溶剂密度达到洗脱剂密度的设定值。

15、进一步的，色谱柱和洗脱剂的温度控制在10℃-30℃之间，并保持色谱柱和洗脱剂恒温且温度一致，洗脱剂与色谱柱的温度差异在±3℃以内。

16、进一步的，轴向加压色谱柱采用无油缸式色谱柱。

17、进一步的，色谱柱流出的馏分经检测，没有目标物多肽的馏分进行溶剂回收，有目标物多肽的馏分进行目标物收集；

18、有目标物多肽的馏分进行目标物纯度检测，对目标物纯度达到预设标准的馏分采用真空冷冻干燥的方式去除溶剂得到目标物固体；目标物纯度未达到预设标准但超过预设的可回收馏分纯度的馏分进行溶剂回收。

19、进一步的，没有目标物多肽的馏分经高精度质量流量计进行比例确认，符合洗脱剂设置比例的馏分直接回收；不符合洗脱剂设置比例的馏分，调整为洗脱剂的设置比例后回收；

20、目标物纯度达到预设标准的馏分在密闭体系中进行真空挥发，馏分中的溶剂经真空挥发分离出来，再经过冷却后凝结成液体溶剂混合物；经高精度质量流量计进行比例确认，调整为洗脱剂的设置比例后回收。

21、进一步的，洗脱剂采用含有挥发性有机溶剂和水的均相溶液，有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、丙酮或四氢呋喃。

22、进一步的，洗脱剂采用纯水或水溶液，所述的纯水或水溶液中加入酸、碱或盐，所述酸、碱或盐为甲酸、乙酸、三氟乙酸、氨水、三乙胺、醋酸铵、碳酸铵或醋酸三乙胺。

23、进一步的，孔径范围在40å以下的微孔占比小于5%。

24、与现有技术相比，本发明所具有的优点和有益效果为：

25、针对2000d以上的分子量较大的多肽，其目标物与杂质类似性高、难分离，容易形成拖尾、形成自聚等特性，为了实现对于大分子量多肽（2000d-6000d）的精准分离，提高载样量、分离度和收率，本发明从整体纯化方法、纯化的相关装置以及色谱填料上通过系统的集成创新，在分离纯化效率、连续工作寿命、分离度和收率等多方面取得了明显的改进。其主要创新是以下几个关键点的集成，重点提升了分离效果、分离精度和整个过程的智能化：

26、（1）在本发明过程中，发明人通过大量的实验设计、以及所产生的大量实验数据的分析对比，找出了微孔对于大分子多肽（大于2000d）的影响规律，发现了微孔（小于70å）和超微孔（小于40å）对于这类大分子多肽色谱分离的严重危害；特别是超微孔（小于40å）不仅不能给大分子多肽提供分离作用，而且会造成拖尾，甚至降低填料的耐压和耐碱性能。通过减少70å以下的微孔，特别是40å以下超微孔，提高孔径的均匀性，不仅降低了多肽在填料上的拖尾，改善了分离，提高了收率，而且提高填料的耐碱性、耐污染（微孔导致的小分子杂质的强吸附）和机械强度，解决了传统硅胶的微孔多、寿命低、不耐碱等在多肽纯化过程中存在的技术问题。本发明在大量的实验结果和数据分析基础上，创造性的给出了针对大分子多肽纯化的优选填料的特征，开发制备出相应的填料，并成功的应用具备这一特征的填料，发明了一个完整的、具备多方面特征的大分子多肽（2000d-6000d）纯化的新方法。

27、本发明还进一步采用了2种或2种以上的硅烷进行混合键合，利用不同硅烷与目标物和杂质具有不同作用的差异，即极性硅烷与目标物、杂质的作用和非极性硅烷与目标物、杂质的作用不同，作用加和后会有提高分离效果，提高选择性，进一步提升色谱填料固定相对于大分子多肽以及其它目标物和杂质在组成和结构非常相似的混合物的分离。这里所述的硅烷不包括用于硅胶封尾的不多于4个碳的封尾剂（有些封尾剂分子虽然本身含碳数超过5，但与硅胶键合后的硅氧基的基团中的含碳数不超过4，依然属于封尾剂，不属于本发明所述的键合用硅烷）。

28、（2）本发明还通过对于色谱柱温度和洗脱剂温度一致性和精准性（温度在10℃-30℃之间可选，洗脱剂与色谱柱的温度差异在±3℃以内，有效的降低拖尾，改善峰形和分离效果。

29、（3）本发明的基于在线超高效液相色谱（柱效超过150000塔板数/m）检测的智能化馏分收集和在线溶剂回收，形成了本领域首个闭环的全自动系统，不仅提高了效率，而且减少了目标产品在收集、检验和后处理过程中的损失，还降低了整个纯化和溶剂回收过程中的溶剂损失和环境污染。

30、本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。