一种GFAP、NFL和UCH-L1联合检测试剂盒及其用于脑创伤早期检测的制作方法

本发明属于医药，具体的涉及一种gfap、nfl和uch-l1联合检测试剂盒，所述试剂盒可应用于脑创伤的早期检测。

背景技术：

1、脑创伤相关疾病，包括创伤性脑损伤（tbi, traumatic brain injury），涉及复杂的病理过程，影响大脑的各种细胞成分。传统的脑创伤诊断方法主要依赖于影像学检查和临床评估，这些方法在早期阶段可能无法检测到微小的损伤。

2、gfap（glial fibrillary acidic protein，胶质纤维酸性蛋白）是一种中间丝蛋白，主要在中枢神经系统（cns, central nervous system）的星形胶质细胞中表达。它在维持星形胶质细胞的结构完整性和cns损伤后的修复过程中起重要作用。在血液和脑脊液（csf）等生物体液中，gfap水平的升高表明星形胶质细胞的损伤或激活，这发生在cns损伤时。在脑创伤中，gfap水平的升高与星形胶质细胞激活和胶质增生的程度相关，反映了损伤的严重程度。

3、nfl（neurofilament light，神经丝轻链）蛋白是一种结构蛋白，构成神经元中的神经丝，提供结构支持并维持轴突的完整性。它对于轴突的正常功能至关重要，轴突是传递神经冲动的神经元长投射。在生物体液中，nfl水平的升高表明轴突损伤或退化，这是许多神经退行性疾病和脑损伤的标志。在脑创伤中，nfl水平的升高与轴突损伤的程度相关，提供了损伤严重性和进展的见解。

4、uch-l1（ubiquitin c-terminalhydrolase-l1，泛素羧基末端水解酶l1）是一种主要在神经元中发现的酶，参与调节蛋白质降解和周转的泛素-蛋白酶体系统。它通过去除损伤或错误折叠的蛋白质来维持神经元的健康和功能。在生物体液中，uch-l1水平的升高与神经元细胞体损伤和神经元死亡相关。在脑创伤中，uch-l1水平的升高与神经元损伤的程度相关，提供了神经元损伤严重性的相关信息。

5、gfap、nfl和uch-l1之间的相关性在于它们分别代表了大脑内不同的细胞成分和损伤机制，提供了脑创伤的多方面视角。在临床应用中，这些生物标志物的早期诊断功能显著。即使在临床症状出现之前。结合测量gfap、nfl和uch-l1可以帮助确定损伤的严重程度，并预测长期结果。定期监测这些生物标志物还可以跟踪损伤的进展和治疗干预的效果。

6、化学发光免疫分析（clia, chemiluminescent immunoassay）是一种高度敏感和特异的诊断技术，用于检测和定量生物样本中的疾病生物标志物。通过目标抗原与特定抗体的结合，然后与化学发光底物反应后会产生光，再通过测量的发光强度与目标生物标志物的浓度成正比，从而实现目标疾病的准确诊断。现有技术中创伤性脑损伤检测通常采用单一的指标（如gfap）进行检测，但是仅用单一指标否并不可靠。并且检测生物标记物（如gfap、nfl和uch-l1）时，化学发光的准确性和稳定性可能受到各种因素的影响。因此，在同时检测多种生物标记物时，迫切需要一种精密度高，检测背景信号低，灵敏度高，线性范围宽的免疫分析方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种gfap、nfl和uch-l1联合检测试剂盒，包括：吖啶酯标记抗体工作液和磁珠包被抗体工作液；所述吖啶酯标记抗体工作液中含有吖啶酯标记的gfap、nfl和uch-l1抗体，所述磁珠包被抗体工作液中含有磁珠包被gfap、nfl和uch-l1抗体；

2、所述磁珠包被抗体工作液由如下组成：0.2～0.4 mg/ml的磁珠包被的gfap、nfl和uch-l1抗体，20～50 mm的tris，100～200 mm的nacl、20～50 mm的mes、1.5～2％的bsa、1.5～2％的蔗糖、0.1～0.2％的tween-20、0.5～1％的胆红素氧化酶、0.05～0.1%抗坏血酸氧化酶和0.005～0.01％的proclin300，所述工作液的ph为7.0～7.5；

3、所述吖啶酯标记的抗体工作液由如下组成：0.6～1.2 μg/ml 吖啶酯标记gfap、nfl和uch-l1抗体，20～50 mm tris 、100～200 mm的nacl、1.5～2％的bsa、1.5～2％的蔗糖、0.1～0.2％的tween-20、0.5～1％的胆红素氧化酶、0.05～0.1%抗坏血酸氧化酶和0.005～0.01％的proclin300，所述工作液的ph为6.0～6.5。

4、本发明磁珠包被抗体工作液、吖啶酯标记的抗体工作液进行了深入研究，在上述工作液中，由tris缓冲液、nacl、bsa、蔗糖、tween-20、胆红素氧化酶、抗坏血酸氧化酶、proclin300成分组成，能够有效地避免gfap、nfl和uch-l1抗原检测的相互干扰，提高三者的检测灵敏度和准确度，对脑创伤患者的早期筛查提供了有效、快速、准确的检测方法。更重要的是，申请人研究发现在上述工作液中通过添加胆红素氧化酶和抗坏血酸氧化酶，有效避免了胆红素和抗坏血酸的干扰，防止反应体系浑浊，底物稳定性、试剂的抗干扰能力均增强。特别地，可有效地提高nfl和uch-l1的灵敏度。优选的，胆红素氧化酶和抗坏血酸氧化酶的重量比为5～10：1。更优选的，两者的重量比为10：1。并且在磁珠包被抗体工作液中添加20～50 mm的mes，利于保持磁珠包被抗体的稳定性，检测试剂盒长期放置稳定性良好。

5、此外，申请人研究还发现工作液的ph也会有影响抗体检测，磁珠包被抗体工作液的ph偏碱性，会影响抗体检测灵敏度、重复性、回收率。优选的，所述磁珠包被抗体工作液的ph为7.0～7.5，所述吖啶酯标记的抗体工作液的ph为为6.0～6.5。

6、在一些实施方案中，所述的试剂盒中还包括处理液，所述处理液由如下组成：25～50 mm的tris、100-200 mm的nacl、2～3％的尿素、1.5～2％的bsa、1.5～2％的蔗糖、0.1～0.2％的tween-20、和0.005～0.01％的proclin300；所述处理液的ph为7.0～7.5。对样品进行预处理，可有效地消除血浆中的血细胞，避免血细胞吞进磁珠的可能，进而提高检测的准确性。特别地，添加了少量尿素，可以快速消除血浆中的红细胞。

7、在一些实施方案中，所述处理液与待测样本的体积比≤3，优选1:2。研究发现，如果处理液与待测样本的体积比过大，样本浓度低，影响样品的检测灵敏度。

8、在一些实施方案中，含有样本的处理液、gfap、nfl和uch-l1磁珠包被抗体工作液和吖啶酯标记gfap、nfl和uch-l1抗体工作液按照体积比为1：2：2配置。

9、在一些实施方案中，所述联合检测试剂盒还包括底物溶液，所述底物溶液为化学发光底物溶液。

10、本发明还提供了一种磁珠包被gfap、nfl和uch-l1抗体的制备工艺，包括以下步骤：

11、1）将gfap、nfl和uch-l1抗体采用透析液进行稀释，然后在2-8℃条件下透析16-24小时，得混合包被抗体溶液；

12、2）将磁珠用包被缓冲液冲洗，向冲洗后的磁珠中加入nhs和edc溶液，混匀后孵育0.5-1小时，清洗磁珠；

13、3）将步骤2）的磁珠加入步骤1)的混合包被抗体溶液中，25℃旋转混匀孵育1-3小时，采用磁珠清洗液1清洗磁珠；

14、4）加入磁珠封闭液于25℃旋转混匀孵育2-4小时，采用磁珠清洗液2清洗磁珠，即得磁珠包被gfap、nfl和uch-l1抗体。

15、在一些实施方案中，步骤1）中所述的透析液为0.1 m pbs缓冲液，ph为 7.8。

16、在一些实施方案中，步骤2）中所述的包被缓冲液为ph 5.0 100 mm mes缓冲液。

17、在一些实施方案中，步骤2）中所述nhs溶液的浓度为0.02～0.1 mg/ml，所述edc溶液的浓度为0.02～0.1 mg/ml。

18、在一些实施方案中，步骤3）中按照磁珠：抗体=50：1（质量比）混合。本技术发明人在实验过程中也尝试过不同配比，其中配比较大，抗体标记效果差，配比较小的，影响底物信号，总体来说优选重量比为50:1效果好。

19、在一些实施方案中，步骤3）中所述磁珠清洗液1由以下成分组成：25 mm tris、150mm nacl、2%明胶。

20、在一些实施方案中，步骤4）中所述磁珠封闭液由以下成分组成：50 mm tris，1％bsa，0.01％triton x-100，0.09％nan3。

21、在一些实施方案中，步骤4）中所述的磁珠封闭液的ph为 8.0。

22、在一些实施方案中，步骤4）中所述的磁珠清洗液2由以下成分组成：25 mm tris、150 mm nacl。

23、在一些实施方案中，所述磁珠为包含羧基官能团的磁性微粒。

24、在一些实施方案中，所述磁珠粒径为20～60 nm。优选的，标记nfl、uch-l1抗体的磁珠选自20～40 nm粒径和40～60 nm粒径两种磁珠，两者重量比3:1。进一步提高了nfl、uch-l1检测线性范围以及灵敏度。

25、本发明还提供了一种磁珠包被gfap、nfl和uch-l1抗体的制备工艺，包括以下步骤：

26、（1）将gfap、nfl和uch-l1抗体用pbs缓冲液（0.1 m，ph 7.8）稀释至1 mg/ml，然后在2-8 ℃条件下采用pbs缓冲液，即得混合包被抗体溶液；

27、（2）将磁珠用ph 5.0 100 mm mes缓冲液冲洗，向冲洗后的磁珠中加入nhs（浓度为0.1 mg/ml）和edc（浓度为0.1 mg/ml）溶液，混匀后在25℃旋转混匀孵育30分钟，再次清洗磁珠。

28、（3）按照磁珠：抗体=50：1（质量比）的比例加入混合包被抗体溶液，25℃旋转混匀孵育2小时，采用磁珠清洗液1，磁珠清洗液为25 mm tris、150 mm nacl、 2%明胶，再次清洗磁珠。

29、（4）加入磁珠封闭液于25℃旋转混匀孵育3小时，磁珠封闭液为50 mm tris，1％bsa，0.01％triton x-100，0.09％nan3，ph 8.0，孵育后的磁珠用磁珠清洗液（25 mm trisph 7.8，150 mm nacl）清洗3次，将清洗好的磁珠重悬至浓度为10 mg/ml，于2-8℃保存待用，即得磁珠包被gfap、nfl和uch-l1抗体。

30、本发明还提供了一种吖啶酯标记的gfap、nfl和uch-l1抗体的制备工艺，包括以下步骤：

31、a）将gfap、nfl和uch-l1待标记抗体用透析液稀释，然后在2-8℃条件下透析16-24小时，得混合待标记抗体溶液；

32、b）将吖啶酯dmso溶液采用标记缓冲液稀释，将稀释吖啶酯溶液与混合待标记抗体溶液混合，在25℃振荡反应2-3小时；

33、c）加入磁珠封闭液于25℃封闭反应20-50 min；

34、d）层析柱进行纯化，即得吖啶酯标记gfap、nfl和uch-l1抗体。

35、在一些实施方案中，步骤a）中所述的透析液为0.1 m pbs缓冲液，所述缓冲液ph为7.8。

36、在一些实施方案中，步骤b）中所述标记缓冲液为0.1 m pbs缓冲液，所述缓冲液ph为 7.8。

37、在一些实施方案中，步骤b）中，按照待标记抗体：吖啶酯=5：1（质量比），本技术发明人在实验过程中也尝试过不同配比，其中配比较大，抗体标记效果差，配比较小的，影响底物信号，总体来说优选重量比为5:1效果好。

38、在一些实施方案中，步骤c）中所述封闭液为含有1％赖氨酸的pbs溶液，ph为7.8。本技术发明人在实验过程中也尝试过封闭剂中含有不同配比赖氨酸的pbs溶液，其中的赖氨酸含量过高，比如2%，总体来说信号值都不如低浓度的效果好。

39、在一些实施方案中，步骤d）中纯化缓冲液为0.1 m pbs缓冲液，ph 为7.8。

40、进一步，本发明还提供了一种吖啶酯标记的gfap、nfl和uch-l1抗体的制备工艺，包括以下步骤：

41、（1）将gfap、nfl和uch-l1待标记抗体用pbs缓冲液（0.1 m，ph 7.8）稀释至0.5 mg/ml，然后在2-8℃条件下采用pbs缓冲液（0.1 m，ph 7.8）透析16-24小时，期间换液不少于4次，每次换液间隔不少于1 小时，即得混合待标记抗体溶液。

42、（2）用pbs缓冲液（0.1 m，ph 7.8）稀释吖啶酯dmso溶液，配制后5分钟内使用，按质量比标记抗体：吖啶酯=5：1，将稀释吖啶酯溶液与混合待标记抗体溶液混合，在25℃振荡反应2小时，全程避光；

43、（3）加入含1％赖氨酸的pbs溶液(0.1 m，ph 7.8)，使赖氨酸的终浓度达到0.25％，25℃封闭反应30 min。

44、（4）层析柱进行纯化，纯化缓冲液为pbs缓冲液（0.1 m，ph 7.8），纯化后的吖啶酯标记抗体重悬至浓度为25 ug/ml，于2-8℃保存待用，即得吖啶酯标记gfap、nfl和uch-l1抗体。

45、进一步，本发明还提供了一种gfap、nfl和uch-l1联合检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

46、(1)向待测样本中加入处理液，在25℃的温度下处理5 min；

47、(2)将包含待测样本的处理液、gfap、nfl和uch-l1磁珠包被抗体的工作液和gfap、nfl和uch-l1吖啶酯标记抗体的工作液按照体积比为1：2：2混合，在25℃的温度下进行反应5 min；

48、(3)将反应后的溶液进行磁分离，收集磁珠；

49、(4)清洗磁珠，然后加入化学发光底物溶液，混匀，检测发光值。

50、在一些实施方案中，其中，所述处理液由如下组成：25～50 mm的tris、100-200 mm的nacl、2～3％的尿素、1.5～2％的bsa、1.5～2％的蔗糖、0.1～0.2％的tween-20、和0.005～0.01％的proclin300，所述处理液的ph为7.0～7.5。

51、进一步，本发明还提供了一种上述gfap、nfl和uch-l1联合检测试剂盒在制备检测早期脑创伤中gfap、nfl和uch-l1抗原的产品中的应用。

52、有益效果：

53、1、本发明提供了一种gfap、nfl和uch-l1检测试剂盒，通过对吖啶酯标记工作液和磁珠标记工作液的组分和各组分含量进行筛选，能够为吖啶酯标记的gfap、nfl和uch-l1抗体和gfap、nfl和uch-l1抗体标记的磁珠提供稳定的工作环境，实现对gfap、nfl和uch-l1的特异性识别和检测，其中，检测灵敏度高和检测范围宽，线性范围良好，gfap的最低检测线可到0.545 pg/ml, nfl的最低检测线可到0.476 pg/ml，uch-l1的最低检测线可到1.568pg/ml；同时，试剂盒检测结果重复性和回收率古符合要求。本发明提供的gfap、nfl和uch-l1检测试剂盒，实现了gfap、nfl和uch-l1三联同时检测，准确度和检测效率都得到极大提高。

54、2、本发明提供的gfap、nfl和uch-l1检测试剂盒，优选的，对样品进行预处理，可以快速消除血浆中的血细胞，有效避免血细胞吞进磁珠的可能。

55、3、本发明提供了gfap、nfl和uch-l1磁珠包被抗体工作液的制备方法，在制备过程中，先采用nhs和edc活化磁珠，提高了gfap、nfl和uch-l1抗体与磁珠的偶联效率；利用mes缓冲液溶解磁珠保证了磁珠的分散稳定性，有效防止因磁珠的凝结而影响检测信号，从而保证检测结果的准确性；试剂盒用于血浆检测时，血液中成分复杂，本发明提供的制备方法在将gfap、nfl和uch-l1抗体与磁珠偶联后加入磁珠封闭液，避免后期检测样本时可能产生的非特异性的结合，进一步保证了检测结果的准确性。使用磁珠封闭液同时实现对磁珠的有效封闭，能够保证gfap、nfl和uch-l1抗体活性，提高试剂盒的检测性能。

56、4、本发明还提供了gfap、nfl和uch-l1吖啶酯标记抗体工作液的制备方法，在制备过程中，加入含有赖氨酸的pbs溶液以终止活化反应，有效避免了非特异性反应的发生，保证了gfap、nfl和uch-l1抗体与吖啶酯的偶联物的稳定性以及抗体的活性。

57、5、本发明还提供了gfap、nfl和uch-l1检测试剂盒的使用方法，该方法操作简单，反应体系均一，稳定性高。