外膜囊泡大规模纯化的微球、纯化方法、外膜囊泡及应用与流程

本发明涉及外膜囊泡，具体涉及外膜囊泡大规模纯化的微球、纯化方法、外膜囊泡及应用。

背景技术：

1、外膜囊泡是一种直径为10−250nm的球状结构，它能运输脂质、蛋白质、核酸、细胞毒素和信号分子等不同物质，具有多种生物学功能，包括细菌与细菌之间的交流、致病因子传递、抵抗外界不良环境和调节免疫反应等。外膜囊泡分为植物外膜囊泡和动物外膜囊泡，相比于动物外膜囊泡，植物外膜囊泡的纯化技术更加复杂，对纯化材料的功能性也更高。

2、例如中国专利cn114540271b公开了一种植物外泌体的纯化方法，通过peg8000沉淀与凝胶过滤层析联合实现大规模和高纯度外泌体的分离纯化，能够同时保证外泌体的含量、纯度、生物活性。

3、例如中国专利cn117070450b公开了一种外泌体的纯化方法，通过超滤加混合层析的方式纯化外泌体，在超滤阶段，采用切向流过滤方式并降低进样压力，以避免外泌体损伤，后续再通过混合模式层析弥补超滤带来的低杂蛋白去除率，通过低渗或高渗缓冲液充分去除蛋白杂质，同时还保证外泌体较高的收率。

4、但是上述专利在过滤层析过程中耗时较长，成本均较高；且纯化的外膜囊泡组分不能完全保持原有形态。

5、基于此，本发明设计了外膜囊泡大规模纯化的微球、纯化方法、外膜囊泡及应用以解决上述问题。

技术实现思路

1、针对现有技术所存在的上述缺点，本发明提供了外膜囊泡大规模纯化的微球、纯化方法、外膜囊泡及应用。

2、为实现以上目的，本发明通过以下技术方法予以实现：

3、一种通用型外膜囊泡大规模纯化的微球；

4、包括：微球载体、磁性微球载体和氧化钛功能化壳层的包覆；

5、所述微球载体包括：二氧化硅微球、聚苯乙烯微球、碳微球中的一种或多种；

6、所述磁性微球载体包括：四氧化三铁磁核、晶化四氧化三铁磁核、氧化硅包覆四氧化三铁磁核、聚苯乙烯包覆四氧化三铁磁核中的任意一种或多种；

7、所述四氧化三铁磁核和晶化四氧化三铁磁核分别由二价铁盐和三价铁盐发生共沉淀反应和水热结晶反应后，在磁场作用下分离得到；

8、所述氧化硅包覆四氧化三铁磁核由四氧化三铁磁核或晶化四氧化三铁磁核在正硅酸四乙酯溶胶凝胶反应中包覆氧化硅，在磁场作用下分离得到；

9、所述聚苯乙烯包覆四氧化三铁磁核由单分散聚苯乙烯/二乙烯基苯微球、十二烷基硫酸钠、三氯化铁和七水合硫酸亚铁混合反应制备得到；

10、所述氧化钛功能化壳层包括：无定型的氧化钛、致密型氧化钛、锐钛矿型氧化钛以及金红石型氧化钛中的一种或多种。

11、更进一步的，所述微球载体和磁性微球载体粒径分布范围为500nm-100μm；所述氧化钛的包覆壳层厚度为1nm-5μm。

12、一种使用所述的微球纯化的纯化方法，选用通用型外膜囊泡大规模磁纯化方法；

13、包括以下步骤：

14、步骤一：制备外膜囊泡粗制液；

15、步骤二：通过磁性微球载体制备磁性氧化钛微球；

16、所述磁性氧化钛微球分为四种，分别是：无定型氧化钛包覆磁核微球、致密型氧化钛包覆磁核微球、锐钛矿型氧化钛包覆磁核微球和金红石壳层包覆磁核微球；

17、a、制备无定型氧化钛包覆磁核微球；

18、b、制备致密型氧化钛包覆磁核微球；

19、c、制备锐钛矿型氧化钛包覆磁核微球；

20、d、制备金红石壳层包覆磁核微球；

21、步骤三：取外膜囊泡粗制液、四种磁性氧化钛微球中的一种或多种以及上样缓冲液充分混匀孵育，将外膜囊泡与磁性氧化钛微球结合；

22、步骤四：采用磁分离手段分离结合有外膜囊泡的磁性氧化钛微球，并用清洗液清洗结合有外膜囊泡的磁性氧化钛微球去除非特异性结合的组分；

23、步骤五：用洗脱液洗脱清洗后的磁性氧化钛微球；洗脱上清液即为分离纯化后的外膜囊泡溶液，洗脱后的外膜囊泡外观形态完整，无破碎或裂解；

24、步骤六：向洗脱液中加入平衡缓冲液平衡ph值，得到便于保存的分离纯化后的外膜囊泡溶液。

25、更进一步的，所述磁性微球载体包括：四氧化三铁磁核、晶化四氧化三铁磁核、氧化硅包覆四氧化三铁磁核、聚苯乙烯包覆四氧化三铁磁核中的任意一种或多种。

26、更进一步的，通用型外膜囊泡大规模磁纯化方法中，外膜囊泡粗制液样本与磁性氧化钛微球混合的体积比为1-2：1；

27、外膜囊泡粗制液样本与上样缓冲液的体积比为10-20：1；

28、单次加入清洗液体积和磁性氧化钛微球体积比例为1-3：1；

29、清洗液清洗步骤重复1-3次；

30、洗脱液与磁性氧化钛微球的体积比为0.5-1：1；

31、平衡液与洗脱液的体积比为2-3：1。

32、一种所述的微球纯化的纯化方法，采用通用型外膜囊泡大规模柱纯化方法；

33、包括以下步骤：

34、步骤一：外膜囊泡粗制液制备；

35、步骤二：通过微球载体制备氧化钛微球；

36、所述氧化钛微球分为四种，分别是：无定型氧化钛包覆微球、致密型氧化钛包覆微球、锐钛矿型氧化钛包覆微球和金红石壳层包覆微球；

37、a、制备无定型氧化钛包覆微球；

38、b、制备致密型氧化钛包覆微球；

39、c、制备锐钛矿型氧化钛包覆微球；

40、d、制备金红石壳层包覆微球；

41、步骤二：取四种氧化钛微球中的一种或多种装进纯化柱中；

42、步骤三：取外膜囊泡粗制液样本与上样缓冲液充分混匀；

43、步骤四：将混合上样缓冲液的外膜囊泡样本加到纯化柱中，加压让样本流穿；

44、步骤五：用清洗液上样，加压让清洗液流穿；

45、步骤六：用洗脱液上样，加压让洗脱液流出，收集洗脱液；

46、步骤七：向洗脱液中加入平衡缓冲液平衡ph值，得到便于保存的分离纯化后的外膜囊泡。

47、更进一步的，所述微球载体包括：二氧化硅微球、聚苯乙烯微球、碳微球中的一种或多种。

48、更进一步的，通用型外膜囊泡大规模柱纯化方法中，外膜囊泡粗制液样本与上样缓冲液的体积比为10-20：1；

49、上样外囊泡粗制液与柱内氧化钛微球的体积比为1-5：1；

50、清洗液与柱内氧化钛微球填料的体积比为1-5：1；

51、洗脱液与柱内氧化钛微球填料的体积比为1-5：1；

52、加入平衡液与洗脱液的体积比为2-3：1。

53、一种由所述的纯化方法得到的外膜囊泡。

54、一种所述的外膜囊泡在制备生物治疗剂或药物递送载体中的应用。

55、本发明相较于现有技术，其有益效果为：

56、1、本发明并不限制外膜囊泡的来源和组成，既能快速、高质量、高通量、低成本大规模纯化动物来源外膜囊泡，也能对植物来源的外膜囊泡达到相同的纯化效果。本发明能够获得完整的外膜囊泡，其形态完整，无破损，可直接用于制备生物治疗剂或药物递送载体。结合磁性微球的特性，能够快速分离和纯化外膜囊泡，还可以进一步地配合相应的仪器设备实现外膜囊泡的高通量、自动化分离纯化。结合柱层析和微球特性，氧化钛微球填料通过一步层析就能够获得高纯度、高回收率的外膜囊泡，适用于大规模产业化外膜囊泡的分离纯化。

57、2、本发明获得的外膜囊泡的纯度更高、回收率更高。微球的整体粒径远大于植物外囊泡的尺寸，功能性氧化钛表面有足够的表面空间结合外囊泡而不产生空间位阻作用，有利于植物外膜囊泡与微球结合，大幅提升外囊泡分离纯化的效率。另外，微球表面的钛酸位点能够精准结合外膜囊泡组分磷脂双层膜表面暴露的磷酸结构位点，并不结合复杂生物样本中的其他组分，纯化获得的外膜囊泡组分样本的纯度更高。

58、3、本发明表面包覆氧化钛的形态包括无定型、致密型、锐钛矿型以及金红石型氧化钛，都能够表现出优异的分离纯化效果。

59、4、本发明对于含有较少外囊泡的样本或者稀释较多的样本也有很好的提取分离效果；如生姜外膜囊泡的分离纯化，分离所得生姜外囊泡的浓度可达1010-1014个/ml。

60、5、本发明中，偏酸性的上样缓冲液具有促进外囊泡与氧化钛表面螯合吸附的作用，这种螯合吸附作用适用于绝大部分的磷脂双层结构囊泡。

61、6、本发明所使用的洗脱液是为近中性或偏碱性的磷酸、碳酸或氨水溶液，提取的植物外囊泡样本后使用成分为偏酸性的平衡液，便于长期储存。