一种益生菌外膜囊泡及其制备方法和在制备抑制癌细胞的药物中的应用

本发明属于生物医药，具体涉及一种益生菌外膜囊泡及其制备方法和在制备抑制癌细胞的药物中的应用。

背景技术：

1、益生菌是一群有助于调节肠道菌群平衡的微生物群落，被广泛用于治疗肠道功能障碍和疾病，例如腹泻、肠易激综合征和炎症性肠病等。研究表明，益生菌通过多种途径维护人体健康，包括调节免疫功能、产生有机酸或抗菌化合物、与其他微生物群相互作用等。大肠杆菌nissle 1917(ecn 1917)是一种研究最多的多功能益生菌，已在临床应用中成功用于治疗慢性炎症性疾病并增强肠道屏障功能。它是唯一被欧洲克罗恩病和结肠炎组织指南推荐为缓解溃疡性结肠炎恶化的有效替代疗法的益生菌，并在一些欧洲国家注册为药物。此外，ecn1917已被证明在缓解溃疡性结肠炎患者的症状上与美沙拉嗪有相当的疗效，并且不携带任何致病因子。多种机制已被证明支持上述有益作用，包括抑制病原体粘附/入侵上皮细胞、调节免疫反应和维持粘膜屏障的完整性。

2、现有研究发现，几乎所有革兰氏阴性细菌和一些革兰氏阳性细菌会在细胞外空间产生纳米级膜囊泡，这种囊泡被称为细胞外囊泡(extracellular vesicles，evs)。革兰氏阴性细菌分泌的evs源自细菌的外膜，因此被称为外膜囊泡(outer membrane vesicles，omvs)，omvs作为细胞内和细胞间生物体通讯的重要手段，对肠道稳态至关重要。这些囊泡的直径在20～250nm之间，具有球形双层磷脂结构。omvs作为细菌分子的天然载体，含有多种生物活性分子，包括脂多糖、肽聚糖、脂质、蛋白质、核酸以及酶等。作为一种分泌机制，omvs允许细菌将其活性物质在受保护的环境中长距离输送到宿主的各个器官产生效应，无需直接的细胞间接触。omvs在细菌与宿主细胞之间的信息传递、免疫反应调节和细胞信号传导中发挥着重要作用。与活细菌或减毒细菌相比，omvs被认为是安全的，因为它们是无细胞的，不可复制，并且仅需很小的剂量就能起到治疗效果。

技术实现思路

1、针对上述现有技术，本发明提供一种益生菌外膜囊泡及其制备方法和在制备抑制癌细胞的药物中的应用，此外膜囊泡来源于益生菌ecn 1917，安全性强，采用差速超速离心的方法制备，步骤简便且制备的外膜囊泡不需要进行修饰和改造；经外膜囊泡处理后肠上皮屏障功能增强，结肠癌细胞的迁移受到显著抑制。

2、为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供益生菌外膜囊泡在制备抑制癌细胞的药物中的应用。

3、进一步，益生菌为o6：k5：h1型大肠杆菌nissle 1917。

4、本发明采取上述技术方案的有益效果是：ecn 1917是治疗肠道疾病使用最广泛的益生菌之一，是一种不致病的且具有良好人类安全记录的遗传易处理革兰氏阴性益生菌，不携带毒力因子。omvs在细菌与宿主细胞之间的信息传递、免疫反应调节和细胞信号传导中发挥着重要作用；与活细菌或减毒细菌相比，omvs被认为是安全的，因为它们是无细胞的，不可复制，且仅需很小的剂量就能起到显著效果。利用质谱技术检测和生物信息学分析，成功鉴定出ecn 1917外膜囊泡(ecn 1917omvs，以下简称omvs)中的765个蛋白质，这些蛋白质在免疫调控、细胞黏附、信号转导等过程中均发挥着重要作用。使用omvs，安全性强，以乳酸脱氢酶(ldh)的释放作为细胞毒性的检测指标，omvs实验组ldh释放显著降低，表明加入omvs不对细胞产生毒性。

5、在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

6、进一步，癌细胞为结肠腺癌细胞。

7、进一步，药物为抑制癌细胞迁移能力的药物。

8、进一步，益生菌外膜囊泡的有效剂量为10μg/ml。

9、本发明采取上述进一步技术方案的有益效果是：结直肠癌是全球第三大常见癌症，然而，其确切病因尚不清楚，大多数结直肠癌病例是散发的，一些遗传和环境因素已被确定为潜在的危险因素。在发展中国家，增加crc风险的生活方式因素包括缺乏身体活动、吸烟、不健康的饮食习惯、饮酒和肥胖。ecn 1917已在临床应用中成功用于治疗慢性炎症性疾病并增强肠道屏障功能，也是唯一的被欧洲克罗恩病和结肠炎组织指南推荐为缓解溃疡性结肠炎恶化的有效替代疗法的益生菌，并在一些欧洲国家注册为药物；此外，ecn 1917已被证明在缓解溃疡性结肠炎患者的症状上与美沙拉嗪有相当的疗效，并且不携带任何致病因子。多种机制已被证明支持上述有益作用，包括抑制病原体粘附/入侵上皮细胞、调节免疫反应和维持粘膜屏障的完整性。omvs可以影响宿主细胞的各种表型，特别是抑制细胞迁移；划痕实验中，omvs能够显著抑制caco-2细胞的迁移能力；上皮细胞渗透性实验显示，omvs处理有助于保护上皮屏障的功能完整性。

10、差异蛋白质组分析显示，宿主细胞的蛋白质组谱被omvs改变，与对照组相比，实验组中有31个蛋白显著下调，41个蛋白显著上调，差异蛋白主要参与脂蛋白代谢过程、蛋白质三聚化、稳定化等生物学过程，主要定位在细胞质的核周区、细胞与细胞的连接处等，具有atp结合、蛋白质结合等分子功能。其中，表达下调的31个蛋白中包括了anxa9，anxa9是一个与细胞迁移密切相关的蛋白，是膜联蛋白家族的成员，包含四个内部重复结构域，每个结构域都包含一个ii型钙结合位点，对于与膜磷脂相互作用至关重要。qpcr分析显示omvs处理的确会下调anxa9的mrna水平，说明omvs是通过干扰anxa9的转录从而下调了蛋白的表达。敲低anxa9蛋白会抑制细胞迁移，且omvs处理后会进一步增强这种抑制作用；此外，omvs处理anxa9过表达的细胞其迁移也会受到抑制。因此，omvs通过下调anxa9的mrna水平从而下调anxa9的蛋白水平，最终抑制细胞的迁移。

11、进一步，益生菌外膜囊泡的制备方法包括以下步骤：

12、(1)将处于对数生长期的细菌离心，收集上清液；

13、(2)过滤去除上清液中残余的细菌；

14、(3)将过滤后的上清液离心，收集底部沉淀；

15、(4)用缓冲液重悬沉淀，离心，再将底部沉淀用缓冲液重悬，即得。

16、进一步，所有操作均在4℃下或冰上进行。

17、进一步，步骤(1)中的离心速度为4500×g，离心时间为25min。

18、进一步，步骤(3)中的离心速度为150000×g，离心时间为90min；步骤(4)中的离心速度为150000×g，离心时间为90min。

19、进一步，益生菌外膜囊泡呈球形或半球形结构，粒径大小为50～250nm，平均粒径为149.4nm。

20、本发明采取上述进一步技术方案的有益效果是：采用差速超速离心的方法，简便易操作，不需要配制复杂的试剂，提取的omvs直接重悬于后续操作需要的缓冲液中，没有其他试剂的干扰，也不需要对omvs进行修饰和改造，且经过检测具有较高的质量和纯度；ompc是omvs的标志蛋白，经蛋白质免疫印迹检测，结果显示差速超速离心的方法成功获得omvs；纳米颗粒追踪分析(nta)结果显示omvs的粒径为50～250nm，平均直径为149.4nm；透射电镜(tem)结果显示，omvs颗粒大小相对均一，呈球形或半球形的典型的双层脂质膜纳米结构。因此，说明制备的omvs质量较好，为omvs的应用奠定了良好的基础。

21、本发明的有益效果是：ecn 1917是治疗肠道疾病使用最广泛的益生菌之一，是一种不致病的且具有良好人类安全记录的革兰氏阴性益生菌。外膜囊泡在细菌与宿主细胞之间的信息传递、免疫反应调节和细胞信号传导中发挥着重要作用；与活细菌或减毒细菌相比，外膜囊泡被认为是安全的，因为它们是无细胞的，不可复制，并且仅需很小的剂量就能起到治疗效果。ldh检测结果表明，加入omvs不对细胞产生毒性。

22、采用差速超速离心的方法，简便易操作，不需要配制复杂的试剂，提取的omvs直接重悬于后续操作需要的缓冲液中，没有其他试剂的干扰，且经过检测具有较高的质量和纯度，omvs粒径为50～250nm，且呈现出典型的双层脂质膜纳米结构，与其他研究中的omvs显示出相似的形态和直径，为omvs的应用奠定了良好的基础。

23、划痕实验中发现，omvs能够显著抑制caco-2细胞的迁移能力；上皮细胞渗透性实验结果显示，omvs处理有助于保护上皮屏障的功能完整性。

24、差异蛋白质组分析结果显示，经omvs处理的caco-2细胞表达下调的蛋白质中包括了anxa9；qpcr分析显示omvs处理的确会下调anxa9的mrna水平，说明omvs是通过干扰anxa9的转录从而下调了蛋白的表达；rna干扰和基因过表达实验，均证实omvs通过下调anxa9的蛋白水平从而抑制细胞迁移的显著相关性。因此，ecn 1917omvs可应用于制备抑制癌细胞的药物中。