一种γδT细胞无血清培养基及其应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一种γδt细胞无血清培养基及其应用。

背景技术：

1、tcr（t cell receptor）是t细胞识别蛋白抗原的特异性受体，根据tcr类型的差异，t细胞可被分类为αβt细胞与γδt细胞。一般我们常说的t细胞实际上是指αβt细胞，占t细胞群体的65%~70%，而γδt细胞作为t细胞的一个重要亚群，占所有t淋巴细胞的0.5%~5%，其tcrs由γ链和δ链组成。γδt细胞是免疫系统的天然监视细胞，在人体中不断巡逻，可以不受主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，mhc）的限制识别目标抗原，并介导抗肿瘤反应，而不会引起移植物抗宿主病（graft versμs host disease，gvhd），被认为是同种异体细胞治疗的理想来源。γδt细胞可以通过直接或间接的方式起到抗肿瘤的目的，同时γδt细胞也是分泌细胞因子（ifn-γ和tnf-α等）重要的早期来源细胞。ifn-γ和tnf-α均通过多种机制抑制癌症的生长。γδt细胞还可分别通过与b细胞、dc细胞、αβt细胞和nk细胞相互作用而发挥其间接抗肿瘤作用。目前扩增γδt细胞最常用的方法是利用小分子双膦酸盐、抗体等选择性激活γδt细胞。传统的方法是从pbmc起始，在培养基中加入唑来膦酸和il-2，往往需要加入血清或血清替代物促进其扩增，否则无法得到大量的γδt细胞，难以运用于大规模制备γδt细胞。血清或血清替代物价格昂贵，成分未知，并且存在批次差异；因此，如何提供一种能显著提高γδt细胞扩增倍数的无血清培养基，用于制备γδt细胞，进而提高γδt细胞在肿瘤细胞治疗和免疫细胞治疗中的作用，成为有待解决的问题。

技术实现思路

1、为了解决背景技术中提到的技术问题，本发明提供γδt细胞无血清培养基及其应用，技术方案为：

2、一种γδt细胞无血清培养基，包括基础培养基和添加复合物，所述的添加复合物由终浓度为0.5~5μm/l的tws119、终浓度为1~10μm/l的mntbap氯化物、终浓度为0.5~2mg/l的dl-α-生育酚乙酸酯、终浓度为1~20μm/l的唑来膦酸以及1500iu/ml il-2组成。

3、优选的，所述的添加复合物由终浓度为2μm/l的tws119、终浓度为3μm/l的mntbap氯化物、终浓度为1mg/l的dl-α-生育酚乙酸酯、终浓度为6μm/l的唑来膦酸以及1500iu/mlil-2组成。

4、优选的，所述的基础培养基为x-vivo15 t细胞无血清培养基或kbm581淋巴细胞无血清培养基的任意一种。

5、一种γδt细胞无血清培养基的应用，包括前述任一所述的一种γδt细胞无血清培养基，用于获得γδt细胞。

6、本发明的有益效果主要在于：本发明通过在基础培养基中添加tws119、mntbap氯化物、dl-α-生育酚乙酸酯、il-2、以及唑来膦酸培养γδt细胞，不需要额外添加血清或血清替代物。通过本发明培养基获得的γδt细胞的细胞活率高，扩增倍数高，car转入γδt细胞的转导效率高，杀伤肿瘤细胞效率高，适合于进一步的科学研究及临床应用研究。

7、本发明的作用机理：tws119通过激活雷帕霉素靶标（mtor）通路、上调抗凋亡蛋白bcl-2的表达和抑制裂解的caspase-3，显著增强γδt细胞的增殖和存活。tws119会以剂量依赖性方式增加颗粒酶b的表达水平，在体外能够增强γδt细胞对肿瘤细胞的细胞溶解活性。mntbap氯化物是一种锰卟啉配合物，是一种超氧化物清除剂，具有抗氧化性能，在car转入γδt细胞后能够保护细胞免于死亡，并迅速恢复活率。生育酚是一种脂溶性抗氧化剂，可保护细胞膜免受氧化损伤，维持活化t细胞的高活率。

技术特征：

1.一种γδt细胞无血清培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加复合物，所述的添加复合物由终浓度为0.5~5μm/l的tws119、终浓度为1~10μm/l的mntbap氯化物、终浓度为0.5~2mg/l的dl-α-生育酚乙酸酯、终浓度为1~20μm/l的唑来膦酸以及终浓度为1500iu/ml的 il-2组成。

2.根据权利要求1所述的一种γδt细胞无血清培养基，其特征在于，所述的添加复合物由终浓度为2μm/l的tws119、终浓度为3μm/l的mntbap氯化物、终浓度为1mg/l的dl-α-生育酚乙酸酯、终浓度为6μm/l的唑来膦酸以及终浓度为1500iu/ml的 il-2组成。

3.根据权利要求1所述的一种γδt细胞无血清培养基，其特征在于，所述的基础培养基为x-vivo15 t细胞无血清培养基或kbm581淋巴细胞无血清培养基的任意一种。

4.一种γδt细胞无血清培养基的应用，其特征在于，包括权利要求1~3任一所述的一种γδt细胞无血清培养基，用于获得γδt细胞。

技术总结本发明属于生物技术领域，具体涉及一种γδT细胞无血清培养基及其应用，培养基包括基础培养基和添加复合物，所述的基础培养基为X‑Vivo15培养基或KBM581培养基的任意一种；所述的添加复合物包括：终浓度为0.5~5μM/L的TWS119、终浓度为1~10μM/L的MnTBAP氯化物、终浓度为0.5~2mg/L的DL‑α‑生育酚乙酸酯、终浓度为1~20μM/L的唑来膦酸。本发明的培养基培养γδT细胞在不需要额外添加血清或血清替代物的条件下，能显著提高γδT细胞扩增倍数，并且能提高CAR转入γδT细胞的转导效率，同时具有良好的CAR‑γδT细胞杀伤肿瘤细胞效率。技术研发人员：林家会,马士棋,陈旭,陈刚受保护的技术使用者：上海吉泰依科赛生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/9/29