一种用于检测拓扑异构酶I裂解-连接活性的免标记荧光检测体系及应用

本发明涉及生物传感器，更具体的说是涉及一种用于检测拓扑异构酶i裂解-连接活性的免标记荧光检测体系及应用。

背景技术：

1、dna拓扑异构酶i(topoi)是一种在真核生物中普遍存在的酶，它在复制、转录和重组等必要dna代谢过程中产生的超螺旋松弛方面发挥着至关重要的作用。topoi的酶促反应机理包括五个步骤：(1)非共价dna结合；(2)单链dna断裂，活性位点酪氨酸残基(tyr723)亲核进攻dna的磷酸骨架导致单链dna断裂，形成共价的3′-磷酸酪氨酸裂解中间体；(3)链旋转，裂解的5′-oh dna末端围绕未切割的dna链旋转以去除超螺旋；(4)dna缺口重连，自由的5′-oh末端在随后的连接步骤中用作亲核试剂，恢复完整的dna链；(5)共价结合酶topoi从dna上解离以及topoi周转。

2、除了其重要的细胞功能外，topoi还是公认的抗癌治疗靶点。喜树碱(cpt)家族药物成员对topoi酶促反应的抑制作用被应用于治疗各种癌症，包括结肠癌、卵巢癌和小细胞肺癌等。大多数癌细胞和健康细胞相比，其复制率和topoi的活性均会增加。在分子水平上，cpts通过以一种高度依赖于dna存在的方式特异性结合蛋白质-dna裂解中间体，从而选择性抑制topoi催化的重连步骤，稳定瞬时共价裂解中间体，当与dna复制机制发生碰撞时发生双链dna断裂，最终导致细胞死亡。因此，cpts的细胞毒性与topoi的细胞内活性水平直接相关，并且依赖于topoi活性复制。另一个决定cpts抗癌治疗有效性的因素是topoi对药物的敏感性。表达topoi的基因发生点突变时会影响cpts与共价裂解中间体的相互作用，从而导致细胞对topoi产生耐药性。

3、测定topoi活性的标准方法中，最常见的是“松弛实验”，它是将dna松弛和凝胶电泳分析相结合，反应产物用etbr或sybr gold染色成像，通过比较超螺旋dna和松弛dna的比例，从而评估topoi的整体催化活性，但该方法耗时且需要专用设备和材料，只有在设备齐全的实验室才能获得。为了区分topoi活性的裂解和连接步骤，科学家开发了裂解实验，其中使用合理设计的dna分子作为与topoi酶结合的捕获探针，二者结合产生的稳态响应通过使用荧光量子点或放射性标记进行监测。然而，这些方法都需要某种类型的标记或二次反应步骤，昂贵耗时，不适合于现场使用以及快速筛选。其他现有topoi水平的测定方法，如elisa、免疫组织化学染色或pcr技术是通过检测蛋白质或mrna的水平来间接测量topoi活性，无法实现对酶活性的直接准确分析。间接测量存在一个明显的缺陷：虽然酶活性可能通过翻译后修饰等机制发生改变，但蛋白质或mrna的数量保持不变，因此蛋白质或mrna的水平可能不是酶活性的真实反映。

4、因此，开发一种便宜、快速且技术简单的topoi裂解-连接活性的高灵敏检测方法具有巨大的临床应用潜力。expar反应使用一个简单的模板和两个酶(切刻内切酶和聚合酶)实现等温指数扩增，在不到30分钟的时间内扩增106-108倍。expar反应与荧光检测方法相结合使酶活性的高灵敏检测成为可能。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种基于expar反应检测肿瘤细胞中topoi裂解-连接活性的免标记荧光检测体系。topoi的裂解-连接活性依赖于由三个短单链寡核苷酸(p1、p2、p3)组成的dna底物(以下称“三链dna底物p1/p2/p3”)。当靶标topoi存在时，三链dna底物p1/p2/p3被topoi特异性连接为双链dna p1/p2p3。p1/p2p3作为后续expar反应的模板，在引物存在的条件下，依次通过聚合、延伸、切割和链置换的循环过程进行expar反应，产生指数级的扩增产物：双链dna p4/p2p3，并释放丰富的g-四链体短单链dna。释放的g-四链体进一步与体系中剩余的p3链发生特异性杂交，启动新一轮的expar反应，产生更多的g-四链体。nmm是一种水溶性卟啉，它能与g-四链体特异性结合，产生明显增强的荧光信号。在不增加操作复杂度的情况下，两个expar反应极大地提高了扩增效率，实现荧光信号显著放大。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种用于检测拓扑异构酶i裂解-连接活性的免标记荧光检测体系，所述免标记荧光检测体系包括三链dna底物p1/p2/p3、expar反应引物；

4、所述p1序列如seq id no.1所示；

5、所述p2序列如seq id no.2所示；

6、所述p3序列如seq id no.3所示；

7、所述引物序列如seq id no.4所示。

8、进一步的，所述免标记荧光检测体系包括1×rcutsmarttm缓冲液、反应缓冲液、dntps、bst dna聚合酶(大片段)、nb.bbvci、nmm(n-甲基卟啉二丙酸ix)、1×nmm反应缓冲液。

9、进一步的，所述1×rcutsmarttm缓冲液为50毫摩尔每升醋酸钾，20毫摩尔每升三乙酸钾，10毫摩尔每升mg(ac)2·4h2o，100微克每毫升重组白蛋白，ph 7.9；

10、所述反应缓冲液为20毫摩尔每升tris-盐酸，10毫摩尔每升硫酸铵，10毫摩尔每升氯化钾，2毫摩尔每升硫酸镁，0.1％x-100，ph 8.8；

11、所述1×nmm反应缓冲液为1毫摩尔每升tris-盐酸，7.5毫摩尔每升氯化钾，10毫摩尔每升氯化镁，ph 8.0。

12、进一步的，所述三链dna底物p1/p2/p3的制备方法为，将等量的所述p1、p2、p3单链dna探针在退火缓冲液中于95℃孵育5分钟，缓慢冷却到室温；

13、所述退火缓冲液为1.5毫摩尔每升氯化镁，10毫摩尔每升tris-盐酸，ph8.0。

14、一种用于检测拓扑异构酶i裂解-连接活性的免标记荧光检测体系在检测拓扑异构酶i裂解-连接活性中的应用。

15、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果为：

16、本发明将指数等温扩增反应(expar)和荧光检测方法相结合，构建了一种三链dna，用于灵敏和无标记检测癌细胞中topoi的裂解-连接活性。该方法大大缩短了样品到结果的周转时间(低至60min)，成本低廉(一次检测的成本仅为0.60美元)；在均相等温环境下进行，不需要精心设计的发夹探针和复杂的修饰/分离步骤；具有极高的灵敏度，检出限为9.49×10-5u/ml；特异性好，可在复杂生物基质中实现对topoi活性的灵敏检测。此外，该方法还可用于topoi抑制剂的筛选，动力学参数的测定，癌细胞中topoi活性的定量以及癌细胞与正常细胞的鉴别。

17、反应仅涉及四条单链dna探针，不需要精心设计发夹结构，大大简化了探针设计。氨基封闭底物最大程度上减少了中间产物或dna反应物非特异性扩增导致的高背景信号。一次expar扩增产物可进一步触发新一轮expar，实现双重信号放大，大大提高检测灵敏度和底物利用率。等温均相下即可进行“一锅”反应，不需要苛刻的温度控制，不需要费力的洗涤/分离步骤。基于expar的分析策略大大缩短了样品到结果的周转时间(低至60min)；实验成本低廉，仅涉及4个单链dna探针(p1、p2、p3、引物)和3个酶(topoi、bst dna聚合酶、nb.bbvci)，使每项测试的估计成本仅为0.6美元。