一种普拉梭菌的培养方法及保存方法

本发明涉及微生物，尤其涉及一种普拉梭菌的培养方法及保存方法。

背景技术：

1、普拉梭菌(faecalibacterium prausnitzii,f.prausnitzii)，又名普氏栖粪杆菌，革兰氏阴性，是柔嫩梭菌类群的优势菌，属于梭菌科，厚壁菌门。普拉梭菌是人类肠道菌群中最重要的细菌之一，占健康人粪便样本中检测到的细菌总数的5-15％，但是在慢性便秘、肠易激综合征、炎症性肠病(包括克罗恩病和溃疡性结肠炎)、结直肠癌、2型糖尿病和代谢性脂肪肝病的患者粪便，普拉梭菌的丰度显著降低。研究表明，普拉梭菌在抗炎、抗肿瘤和改善脂质代谢方面具有广阔的应用前景。然而，普拉梭菌对氧极为敏感，且其无法合成丙氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、丝氨酸和色氨酸等必需氨基酸，对培养条件的要求及其苛刻，且在摇瓶发酵时提高普拉梭菌效价的条件也极为苛刻，因此亟需开发一种培养方法能够提高普拉梭菌效价同时能够使普拉梭菌发酵液中的活菌数量保持在一个较为稳定的区间。与此同时，目前并没有一种适合普拉梭菌并能保持高存活率的保存方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种能够大幅度提高普拉梭菌活菌数量的培养方法及适合普拉梭菌保存的方法。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

3、第一方面，本发明提供了一种普拉梭菌的培养方法，其包括以下步骤：

4、(1)将普拉梭菌的甘油菌接种至ycfa液体培养基中，在厌氧、35-37℃下培养16-19h，得到一级种子液；

5、(2)将步骤(1)所得一级种子液接种至ycfa液体培养基中，在厌氧、35-37℃下静置培养7-9h，得到二级种子液；

6、(3)将步骤(2)所得二级种子液接种至ycfa液体培养基中，在厌氧、35-37℃下静置培养16-19h，得到普拉梭菌发酵液。

7、本发明通过将普拉梭菌在ycfa液体培养基中复苏、活化和发酵，能够有效提高普拉梭菌发酵液中的活菌数，活菌数最高可达109cfu/ml。

8、作为本发明所述培养方法的优选实施方式，包括如下(ⅰ)～(ⅲ)中的至少一种：

9、(ⅰ)在步骤(1)中，所述普拉梭菌的甘油菌接种量为9-12％；

10、(ⅱ)在步骤(2)中，所述一级种子液的接种量为4-6％；

11、(ⅲ)在步骤(3)中，所述二级种子液的接种量为0.5-1％。

12、作为本发明所述培养方法的优选实施方式，所述ycfa液体培养基包括以下组分：10g/l胰蛋白胨、2.5g/l酵母提取物、4.0g/l碳酸氢钠、2.0g/l葡萄糖、2.0g/l麦芽糖、2.0g/l纤维二糖、1.0g/l半胱氨酸盐酸盐、150ml/l矿物溶液ⅰ、150ml/l矿物溶液ⅱ、1mg/l刃天青、6.2ml/l有机酸混合液、10.0ml/l血红素溶液、1.0ml/l维生素溶液ⅰ、1.0ml/l维生素溶液ⅱ。

13、作为本发明所述培养方法的优选实施方式，其包括如下(ⅳ)～(ⅴ)中的至少一种：

14、(ⅳ)所述ycfa液体培养基中的矿物溶液ⅰ为3.0g/l的磷酸氢二钾水溶液；

15、(ⅴ)所述ycfa液体培养基中的矿物溶液ⅱ包括以下组分：3.0g/l磷酸二氢钾、6.0g/l硫酸铵、6.0g/l氯化钠、0.6g/l七水硫酸镁、0.6g/l二水氯化钙。

16、作为本发明所述培养方法的优选实施方式，其包括如下(ⅳ)～(ⅴ)中的至少一种：

17、(ⅵ)所述ycfa液体培养基中的血红素溶液包括以下组分：2.8g/l氢氧化钾、250ml/l无水乙醇和1.0g/l氯高铁血红素；

18、(ⅶ)所述ycfa液体培养基中的有机酸混合液包括以下组分：17.0ml醋酸、6.0ml丙酸、1.0ml正戊酸、1.0ml异戊酸和1.0ml异丁酸。

19、作为本发明所述培养方法的优选实施方式，其包括如下(ⅷ)～(ⅸ)中至少一种：

20、(ⅷ)所述ycfa液体培养基中的维生素溶液ⅰ包括以下组分：0.01g/l生物素、0.01g/l维生素b12、0.03g/l对氨基苯甲酸、0.05g/l叶酸和0.15g/l盐酸维生素b6；

21、(ⅸ)所述ycfa液体培养基中的维生素溶液ⅱ包括以下组分：0.05g/l盐酸硫胺素和0.05g/l核黄素。

22、第二方面，本发明提供了一种普拉梭菌的保存方法，其包括以下步骤：

23、s1、将上述所得普拉梭菌发酵液在4-8℃下离心，得到普拉梭菌菌体；

24、s2、利用磷酸缓冲液重悬步骤s1所得普拉梭菌菌体，得到普拉梭菌菌泥；

25、s3、将步骤s2所得普拉梭菌菌泥与冻存保护剂混合，置于-80℃下冻存；所述普拉梭菌菌泥与冻存保护剂的体积比为1:1。

26、作为本发明所述保存方法的优选实施方式，在步骤s1中，所述离心条件为离心转速7000-8000g、离心时间6-8min。

27、作为本发明所述培养方法的优选实施方式，在步骤s1和s2中，所述步骤s2所得普拉梭菌菌泥与普拉梭菌发酵液体积比为普拉梭菌菌泥：普拉梭菌发酵液＝1:(35-45)。

28、作为本发明所述保存方法的优选实施方式，在步骤s3中，所述冻存保护剂包括以下质量百分比的组分：10-15wt％麦芽糊精、5-10wt％海藻糖、1-5wt％精氨酸、1-5wt％组氨酸，余量为水。

29、本发明通过对渗透性、半渗透性和非渗透性辅料进行筛选，根据各个辅料对普拉梭菌活菌数量的影响进行pb实验设计，得到12种冻存保护剂配方，通过实验证实当冻存保护剂为10-15wt％麦芽糊精、5-10wt％海藻糖、1-5wt％精氨酸和1-5wt％组氨酸时，经过低温保存的普拉梭菌存活率仍高达83.16％，这表明本发明筛选得到的冻存保护剂更适合普拉梭菌。

30、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

31、(1)本发明通过将普拉梭菌在ycfa液体培养基中复苏、活化和发酵，能够有效提高普拉梭菌发酵液中的活菌数，活菌数最高可达109cfu/ml。

32、(2)本发明通过对渗透性、半渗透性和非渗透性辅料进行筛选，根据各个辅料对普拉梭菌活菌数量的影响进行pb实验设计，得到12种冻存保护剂配方，通过实验证实当冻存保护剂为10-15wt％麦芽糊精、5-10wt％海藻糖、1-5wt％精氨酸和1-5wt％组氨酸时，经过低温保存的普拉梭菌存活率仍高达83.16％，这表明本发明筛选得到的冻存保护剂更适合普拉梭菌。

技术特征：

1.一种普拉梭菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，包括如下(ⅰ)～(ⅲ)中的至少一种：

3.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述ycfa液体培养基包括以下组分：10g/l胰蛋白胨、2.5g/l酵母提取物、4.0g/l碳酸氢钠、2.0g/l葡萄糖、2.0g/l麦芽糖、2.0g/l纤维二糖、1.0g/l半胱氨酸盐酸盐、150ml/l矿物溶液ⅰ、150ml/l矿物溶液ⅱ、1mg/l刃天青、6.2ml/l有机酸混合液、10.0ml/l血红素溶液、1.0ml/l维生素溶液ⅰ、1.0ml/l维生素溶液ⅱ。

4.如权利要求3所述的培养方法，其特征在于，包括如下(ⅳ)～(ⅴ)中的至少一种：

5.如权利要求3所述的培养方法，其特征在于，包括如下(ⅵ)～(ⅶ)中的至少一种：

6.如权利要求3所述的培养方法，其特征在于，包括如下(ⅷ)～(ⅸ)中至少一种：

7.一种普拉梭菌的保存方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.如权利要求7所述的保存方法，其特征在于，在步骤s1中，所述离心条件为离心转速7000-8000g、离心时间6-8min。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤s1和s2中，所述步骤s2所得普拉梭菌菌泥与普拉梭菌发酵液体积比为普拉梭菌菌泥：普拉梭菌发酵液＝1:(35-45)。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤s3中，所述冻存保护剂包括以下质量百分比的组分：10-15wt％麦芽糊精、5-10wt％海藻糖、1-5wt％精氨酸、1-5wt％组氨酸，余量为水。

技术总结本发明涉及一种普拉梭菌的培养方法及保存方法，属于微生物技术领域。本发明普拉梭菌的培养方法包括以下步骤：将普拉梭菌的甘油菌接种至YCFA液体培养基中，在厌氧、35‑37℃下培养16‑19h，得到一级种子液；将上述所得一级种子液接种至YCFA液体培养基中，在厌氧、35‑37℃下静置培养7‑9h，得到二级种子液；将上述所得二级种子液接种至YCFA液体培养基中，在厌氧、35‑37℃下静置培养16‑19h，得到普拉梭菌发酵液。本发明通过将普拉梭菌在YCFA液体培养基中复苏、活化和发酵，能够有效提高普拉梭菌发酵液中的活菌数，活菌数最高可达10<supgt;9</supgt;CFU/mL。技术研发人员：周永健,陈慧婷,郝淮杰,黄琛,李艳红,杨思琪受保护的技术使用者：广州市第一人民医院（广州消化疾病中心、广州医科大学附属市一人民医院、华南理工大学附属第二医院）技术研发日：技术公布日：2024/9/29