一种生物能量活性外泌体的制备方法及其应用

本申请涉及分子生物学，尤其涉及一种生物能量活性外泌体的制备方法及其应用。

背景技术：

1、生物能量是维持细胞合成代谢、增殖和分化的主要驱动力，组织再生依赖于丰富和持续的能量供应(1)；而在哺乳动物细胞中特别是在组织再生过程中，atp是细胞内的重要能量来源，其分子结构中高能磷酸键的断裂伴随着能量的释放，维持细胞内各类反应的进行。目前的研究表明，细胞的生物能量状态与组织再生密切相关，然而在病理性微环境中，细胞合成代谢降低，细胞内能量供应不足导致组织再生困难，尤其是像骨关节炎这类退行性疾病和软骨缺损类疾病等，由于软骨的合成代谢是人类细胞外空间中进行的最耗能的过程之一，软骨细胞能量供给不足、代谢速度缓慢，很难迅速到达缺损部位发挥修复的功能，再加上软骨细胞数量较少，深层区bmscs难以迅速分化，导致软骨组织一旦损伤很难自我愈合；同时目前在促进软骨相关细胞(骨髓间充质干细胞、软骨细胞)内源性atp生成并影响下游相关基因的表达方面，鲜少有研究及应用。

2、外泌体是由细胞分泌的一类细胞外囊泡，其粒径约60nm～150nm，通常携带包括dna、rna、脂质、代谢物以及细胞溶质和细胞表面蛋白质等多种生物活性分子，外泌体形成了一种全新的细胞-细胞间信息传递网络，可参与细胞通讯、细胞迁移等，尤其是间充质干细胞外泌体，已在组织修复与再生领域获得广泛研究。而普通干细胞外泌体活性无法弥补受损细胞能量匮乏的窘状，而且促进细胞能量代谢并提高细胞atp合成水平一般采用外源性添加活性物质，但是外源性添加活性物质不可避免的会发生活性物质易失活、时效短、需反复多次添加等问题，只能短暂的维持细胞活力，无法应对组织缺损再生中的能量需求。目前尚未有研究及应用报道关于具有能量效应的外泌体促进细胞内源性atp生成案例。

技术实现思路

1、本申请提供了一种生物能量活性外泌体的制备方法及其应用，以解决现有技术中采用外源性添加活性物质促进细胞能量代谢并提高细胞atp合成水平存在的活性物质易失活、时效短、需反复多次添加的技术问题。

2、第一方面，本申请提供了一种生物能量活性外泌体的制备方法，所述制备方法包括：

3、采用琥珀酸刺激细胞至预设细胞融合度，得到融合细胞；以及，

4、于无血清环境中对所述融合细胞进行培养，后对培养后的融合细胞进行纯化，得到具有生物能量活性的外泌体；

5、其中，所述琥珀酸的浓度为50μm～2000μm；

6、所述刺激的时间≥24h。

7、可选的，所述琥珀酸的浓度为200μm～1000μm。

8、可选的，所述细胞包括干细胞和/或软骨细胞。

9、可选的，所述干细胞包括骨髓间充质干细胞。

10、可选的，所述细胞的初始细胞融合度≤50％。

11、可选的，所述预设细胞融合度≥80％。

12、可选的，所述于无血清环境中对所述融合细胞进行培养，后对培养后的融合细胞进行纯化，得到具有生物能量活性的外泌体，包括步骤：

13、于无血清环境中对所述融合细胞进行培养，得到培养后的融合细胞；

14、对培养后的所述融合细胞进行梯度离心和过滤，后对滤渣进行高速离心，得到含外泌体的粗粒；以及，

15、对所述含外泌体的粗粒进行洗涤，得到具有生物能量活性的外泌体。

16、可选的，所述梯度离心的离心力为300×g～2500×g；和/或，

17、所述高速离心的离心力≥100000×g。

18、可选的，所述梯度离心的时间为15min～30min；和/或，

19、所述高速离心的时间为1.5h～2.5h。

20、第二方面，本申请提供了一种生物能量活性外泌体的应用，所述应用包括将第一方面所述的制备方法所得的外泌体作为组织再生的活性物质。

21、本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：

22、本申请实施例提供的一种生物能量活性外泌体的制备方法，由于三羧酸(tca)循环是哺乳动物中最有效率的能量产生机制，因此通过三羧酸循环中间体的琥珀酸刺激细胞，可以激活细胞内琥珀酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶等tca循环关键酶的表达，以此可以加速tca循环效率，从而使得细胞内源性atp水平上升，以此可以获得高能量状态的细胞，再对细胞进行纯化，可以得到具有生物能量活性的外泌体，由于外泌体是一种极易被细胞融合的细胞外囊泡，相比外源性添加活性物质，其不易失活，可以被细胞快速融合，且具有较长的作用时间的有点，因此无需反复添加。

技术特征：

1.一种生物能量活性外泌体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述琥珀酸的浓度为200μm～1000μm。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述细胞包括干细胞和/或软骨细胞。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述干细胞包括骨髓间充质干细胞。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述细胞的初始细胞融合度≤50％。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述预设细胞融合度≥80％。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述于无血清环境中对所述融合细胞进行培养，后对培养后的融合细胞进行纯化，得到具有生物能量活性的外泌体，包括步骤：

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述梯度离心的离心力为300×g～2500×g；和/或，

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述梯度离心的时间为15min～30min；和/或，

10.一种生物能量活性外泌体的应用，其特征在于，所述应用包括将如权利要求1-9任一项所述的制备方法所得的外泌体作为组织再生的活性物质。

技术总结本申请涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种生物能量活性外泌体的制备方法及其应用；所述制备方法包括：采用琥珀酸刺激细胞至预设细胞融合度，得到融合细胞；以及，于无血清环境中对所述融合细胞进行培养，后对培养后的融合细胞进行纯化，得到具有生物能量活性的外泌体；琥珀酸的浓度为50μM～2000μM；刺激的时间≥24h；采用三羧酸循环中间体琥珀酸刺激细胞并制备得到具有高生物能量活性的外泌体，与常规的外泌体相比，该高生物能量活性的外泌体可以刺激细胞内ATP含量显著提升，同时可以促进细胞内源性ATP合成，提高合成代谢水平。技术研发人员：张胜民,杜莹莹,姜尚彤,刘须龙受保护的技术使用者：华中科技大学技术研发日：技术公布日：2024/9/29