一株产低胶原活性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌及其应用

本发明涉及一株高产低胶原蛋白活性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌bldj，属于生物工程。

背景技术：

1、解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)，又名淀粉液化芽孢杆菌，属于细菌域，细菌界，厚壁菌门，芽孢杆菌纲，核衣细菌目，芽孢杆菌科，是一类好氧、产芽孢的革兰氏阳性菌，广泛存在于土壤、空气和动物肠道内。解淀粉芽孢杆菌是fda公认的安全微生物，其最适生长温度为30-40℃，在低于15℃或高于50℃条件下均不能生长。解淀粉芽孢杆菌也可以像其他芽孢杆菌一样在恶劣条件下形成椭圆形的内生孢子、宽约0.6-0.8μm，长约1.0-14μm。一旦形成芽孢，细胞即进入休眠状态，在很长的一段时间内都可以稳定的存在。解淀粉芽孢杆菌具有较强的代谢功能，例如酶制剂以及含核苷类、氨基酸类、抗菌物质在内的多种活性物质。

2、蛋白酶是一类能催化蛋白质水解产生游离氨基酸和多肽片段的酶的总称，是目前应用最广泛的工业酶制剂之一。其中微生物源蛋白酶中以芽孢杆菌蛋白酶的研究最为广泛，商业化程度最高。芽孢杆菌蛋白酶在食品工业、生物医药、动物饲料皮革等行业具有广泛的应用价值。其中，蛋白酶在皮革行业的脱毛流程中具有替代传统灰碱法的潜力。脱毛是皮革生产预处理过程中的重要一步，其是指将毛发从牛皮、羊皮等皮面上去除。传统工艺条件下，皮革脱毛采用灰碱法，会引入大量化学试剂，且产生的脱毛废水中cod和bod含量极高，是皮革生产过程中污染较重的环节。作为一种环境友好的替代品，蛋白酶可作用于毛发与皮革的连接处，从而将毛发脱离皮革表面，且保留完整毛发，从而替代部分化学品，减少环境压力，实现清洁生产。但是，蛋白酶一般存在较高的胶原蛋白活性，在皮革脱毛过程中会破坏皮面胶原蛋白结构，造成粒面结构破坏，出现烂面现象，严重影响皮革质量，导致经济损失。

3、针对以上问题，筛选得到一株高产蛋白酶菌株，且其蛋白酶的胶原蛋白活性较低，有助于蛋白酶在皮革脱毛过程中的应用，提供一种绿色皮革脱毛方法。

技术实现思路

1、为解决目前存在的问题，本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)bldj。

2、本发明所述解淀粉芽孢杆菌bldj分离自某豆瓣酱传统生产企业酱醅，经鉴定确定为解淀粉芽孢杆菌，并编号为bldj。

3、本发明的第一个方面提供一株解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)bldj，已于2024年4月10日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为cgmcc no.30293，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

4、本发明同时提供解淀粉芽孢杆菌bldj的培养方法，将所述解淀粉芽孢杆菌bldj接种于营养肉汤液体培养基中，于35-37℃、180-220rpm震荡培养8-12h，至对数生长中后期，获得解淀粉芽孢杆菌bldj种子液。

5、在一些优选的实施方式中，本发明提供的解淀粉芽孢杆菌bldj的培养方法中，将所述解淀粉芽孢杆菌bldj以1-5％的接种量接种于营养肉汤液体培养基。

6、本发明还提供解淀粉芽孢杆菌bldj的发酵方法，将解淀粉芽孢杆菌bldj种子液以5-15％的接种量接种于玉米粉-豆饼粉液体培养基中，于35-40℃、180-220rpm震荡培养40-48h。

7、再一个方面，本发明提供一种微生物菌剂，所述微生物菌剂中含前文所述解淀粉芽孢杆菌bldj。

8、在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂含有所述解淀粉芽孢杆菌bldj菌体的活细胞、冷冻干燥得到的所述解淀粉芽孢杆菌bldj干菌体、固定化的所述解淀粉芽孢杆菌bldj细胞、所述解淀粉芽孢杆菌bldj的液体菌剂、所述解淀粉芽孢杆菌bldj的固体菌剂，或者以其他任何形式存在的所述解淀粉芽孢杆菌bldj菌株。

9、在一些优选的实施方式中，所述微生物菌剂为液体菌剂；

10、进一步地，所述微生物菌剂由前文所述发酵方法获得的发酵液的上清液制得。

11、进一步地，所述的微生物菌剂，蛋白酶的胶原蛋白酶活不超过624.11u/ml。

12、在一些优选的实施方式中，所述的微生物菌剂，在ph为7.5时，以干酪素为底物其蛋白酶酶活达到5503.92u/ml。

13、本发明同时提供一种低胶原活性蛋白酶，由前文所述解淀粉芽孢杆菌bldj或前文所述微生物菌剂，发酵后分离后制得。

14、本发明还提供了所述解淀粉芽孢杆菌bldj，或所述微生物菌剂，或所述低胶原活性蛋白酶在皮革脱毛中的应用。

15、进一步地，在脱毛过程中加入稀释至酪蛋白酶活为80-120u/ml浓度的酶溶液。

16、本发明的一种实施方法中，以干酪素和胶原蛋白为底物分别测定解淀粉芽孢杆菌bldj发酵产粗酶液的酪蛋白酶活和胶原蛋白酶活。

17、有益效果

18、本发明提供了一株高产低胶原活性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌bldj，该菌株该菌株在高产蛋白酶的前提条件下，其分泌蛋白酶的胶原蛋白活性较低。该菌株产蛋白酶在皮革脱毛过程中进行应用不仅可以有效除去毛发，同时对皮面胶原蛋白破坏较小，有助于减缓利用蛋白酶脱毛时产生的烂面现象。

19、生物材料保藏

20、解淀粉芽孢杆菌，分类命名为解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)bldj，已于2024年4月10日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为cgmcc no.30293，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

技术特征：

1.一株解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)bldj，已于2024年4月10日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为cgmcc no.30293，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

2.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌bldj的培养方法，其特征在于，将所述解淀粉芽孢杆菌bldj以接种于营养肉汤液体培养基中，于35-37℃、180-220rpm震荡培养8-12h，至对数生长中后期，得到解淀粉芽孢杆菌bldj种子液。

3.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌bldj的发酵方法，其特征在于，将解淀粉芽孢杆菌bldj种子液以5-15％的接种量接种于玉米粉-豆饼粉液体培养基中，于35-40℃、180-220rpm震荡培养40-48h。

4.含有权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌bldj的微生物菌剂。

5.如权利要求4所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为液体菌剂；由权利要求3所述发酵方法获得的发酵液的上清液制得。

6.如权利要求5所述的微生物菌剂，其特征在于，胶原蛋白酶活不超过624.11u/ml。

7.如权利要求4或5所述的微生物菌剂，其特征在于，在ph为7.5时，以干酪素为底物其蛋白酶酶活达到5503.92u/ml。

8.一种低胶原活性蛋白酶，其特征在于，由权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌bldj或权利要求4所述微生物菌剂，发酵后分离后制得。

9.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌bldj，或权利要求4-7中任一项所述微生物菌剂，或权利要求8所述低胶原活性蛋白酶在皮革脱毛中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，在脱毛过程中加入稀释至酪蛋白酶活为80-120u/ml浓度低胶原活性蛋白酶溶液。

技术总结本发明公开了一株高产低胶原活性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌BLDJ，属于生物工程发酵技术领域。所述解淀粉芽孢杆菌BLDJ已于2024年4月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.30293，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。该菌株在高产蛋白酶的前提条件下，其分泌蛋白酶的胶原蛋白活性较低，胶原蛋白酶活仅为市售蛋白酶的9.55％。该菌株产蛋白酶在皮革脱毛过程中进行应用不仅可以有效除去毛发，同时对皮面胶原蛋白破坏较小，在皮革脱毛过程中进行应用可以显著降低蛋白酶对皮面胶原蛋白的损伤程度，提升皮革品质。技术研发人员：钮成拓,任涛,李崎,刘春凤受保护的技术使用者：江南大学技术研发日：技术公布日：2024/9/29