一株马立克病病毒双基因编辑缺失疫苗株SD01ΔmeqΔM11及构建和应用

本发明涉及一株基于马立克病病毒特超强中国变异株的meq和mir-m11双基因编辑缺失的md疫苗候选毒株sd01δmeqδm11及构建和应用，属于动物病毒学领域。

背景技术：

1、马立克病(md)是因早期感染马立克病病毒(mdv)而诱发的一种最重要的家禽免疫抑制病与肿瘤病，每年给全球养禽业造成巨大经济损失。与md有关的家禽疱疹病毒，包括三种不同血清型，分别为血清ⅰ型(mdv-1)即禽疱疹病毒2型(gaahv-2)、血清ⅱ型(mdv-2)即禽疱疹病毒3型(gaahv-3)和血清ⅲ型(mdv-3)即火鸡疱疹病毒(hvt)/(meahv-1)。其中只有mdv-1分离株具有致病和致瘤性。作为首个成功应用疫苗控制的病毒性肿瘤病，md曾在上世纪末的数十年中得到了良好控制。但md疫苗的长期使用及超强的免疫压力，导致mdv流行毒株持续进化及毒力不断增强。近年来，一些特超强mdv(vv+mdv)毒株，特别是最近从md疫苗免疫鸡群发病病例中分离到的特超强毒mdv变异株(hv-mdv)，被证实已全面突破了当前广泛使用的经典md疫苗的免疫保护，很可能是导致近期全球养禽业md病例频繁爆发的主要原因，给家禽养殖业造成严重危害和巨大损失。

2、meq基因是mdv的主要致瘤基因，有学者利用细菌人工染色体(bac)和基因同源重组技术，敲除mdv强毒株的meq基因后发现病毒不再具有致瘤作用，这一发现揭示了meq基因在mdv致瘤中发挥关键作用。在随后的研究中，以meq基因为主要靶标，进行病毒基因组改造来构建一系列的md基因缺失疫苗候选毒株，如rmd5δmeq、md5bacδmeqδlorf9、686bac-δmeqδvil8、rmsδmeq和sc9-1等，已成为本世纪最近20年新型md疫苗研究的热点。然而，受众多未明因素影响，绝大多数的meq基因缺失候选毒株仍存在对宿主的免疫抑制或免疫保护效力不足等问题。我们通过前期研究发现mdv-1编码mirna在md肿瘤形成过程中发挥着重要作用，且mid基因簇的mir-m11缺失后可以显著增强mdv的体外复制能力，其可能是调控mdv复制的关键基因。

3、因此，利用最新分离的mdv特超强毒中国变异株作为md新型高效疫苗研发的亲本毒株，再结合crispr/cas9基因编辑技术构建双基因缺失疫苗候选毒株，开发新的更加高效的md疫苗，能有效解决当前经典md疫苗免疫鸡群频繁爆发md的窘境，为md的有效防控保驾护航。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一株基于马立克病病毒特超强中国变异株的双基因缺失的md疫苗候选毒株sd01δmeqδm11及构建和应用。

2、为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

3、一株马立克病病毒meq和mir-m11双基因编辑缺失的疫苗候选毒株sd01δmeqδm11，所述马立克病病毒meq和mir-m11双基因编辑缺失疫苗候选毒株为sd01δmeqδm11，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.45863。

4、所述疫苗候选毒株sd01δmeqδm11的亲本毒株为分离自中国鸡群流行的特超强马立克病病毒变异株sdcw01，该亲本毒株的全基因组核苷酸序列全长为175246bp，如seqid no.1所示。

5、所述疫苗候选毒株sd01δmeqδm11是以马立克病病毒特超强中国变异株sdcw01为亲本毒株，将其基因组中的两个meq等位基因分别编辑缺失一个长度同为925bp的片段，基因缺失的分子标记位点分别为：第4515～5440位和133626～134551位；在此基础上又将基因组中的两个mir-m11等位基因分别编辑缺失一个长度为304bp的片段，基因缺失的分子标记位点分别为：第4000～4304位和134762～135066位。

6、所述马立克病病毒meq和mir-m11双基因编辑缺失疫苗候选毒株sd01δmeqδm11的构建方法，基于crispr/cas9基因编辑技术，首先敲除两个meq等位基因，然后再敲除两个mir-m11等位基因构建而成。

7、所述马立克病病毒meq和mir-m11双基因编辑缺失疫苗候选毒株sd01δmeqδm11在鸡马立克病新型高效疫苗制备中的应用。

8、所述鸡马立克病新型疫苗为以sd01δmeqδm11为疫苗株构建的鸡马立克病基因工程疫苗、鸡马立克病多联疫苗或鸡马立克病多价疫苗；或者以sd01δmeqδm11为亲本毒株构建的鸡马立克病基因工程疫苗、鸡马立克病多联疫苗或鸡马立克病多价疫苗。

9、所述鸡马立克病基因工程疫苗为基因缺失疫苗、基因重组疫苗或病毒载体疫苗。

10、所述应用包括但不仅限于利用所述马立克病病毒meq和mir-m11双基因编辑缺失疫苗候选毒株sd01δmeqδm11的病毒粒子、病毒核酸dna及全基因组序列信息。

11、本发明有益效果：

12、1、本发明的马立克病病毒sdcw01的meq和mir-m11双基因编辑缺失毒株sd01δmeqδm11，是以国内最新流行hv-mdv中国变异株为亲本毒株、利用crispr/cas9基因编辑技术构建的meq和mir-m11双基因缺失疫苗候选毒株。通过meq和mir-m11双基因缺失毒株构建及鉴定、1日龄spf鸡免疫攻毒保护评价等一系列实验研究，证实sd01δmeqδm11可以作为一株新型高效的md基因工程疫苗候选毒株，能提供全面可靠的实验依据。本发明针对当前国内鸡群流行的mdv优势毒株尤其是hv-mdv中国变异株，研制了新型的双基因缺失疫苗毒株，可提供很好的免疫保护效率，填补了我国新一代md基因工程疫苗研发的空白。

13、2、本发明提供的马立克病病毒meq和mir-m11双基因缺失疫苗候选毒株sd01δmeqδm11的亲本毒株为sdcw01，是2021年从华中地区某家禽养殖场疫苗免疫但爆发md疫情的蛋鸡群中分离得到的，并通过病毒全基因组测序分析、1日龄spf鸡攻毒实验以及md疫苗免疫保护攻毒实验等一系列的mdv致病性分析及致病型鉴定实验，将其定义为马立克病病毒特超强中国变异株(hv-mdv中国变异株)，该毒株可很好的代表当前国内鸡群流行的mdv优势毒株，该毒株来源及遗传背景清晰。

14、3、本发明的双基因编辑缺失毒株sd01δmeqδm11，通过pcr鉴定、基因克隆测序、rt-qpcr分析、ifa鉴定等，证实该毒株的meq和mir-m11双等位基因完全缺失且传代稳定性良好。spf鸡免疫攻毒保护实验结果显示，sd01δmeqδm11具有很好的免疫保护性，对当前国内hv-mdv流行毒株hnsq01的免疫保护指数(pi)高达100％。因此，本发明构建的sd01δmeqδm11毒株不仅可作为最新md基因缺失疫苗候选毒株，还可用于后续md新型高效基因工程疫苗的开发和利用。

15、4、本发明提供的马立克病病毒meq和mir-m11双基因缺失疫苗候选毒株sd01δmeqδm11的病毒粒子和病毒核酸dna，可以在其基础上继续利用crispr/cas9等基因编辑技术，构建更多的马立克病基因工程疫苗，如基因缺失、基因重组或病毒载体疫苗等，为新一代md高效疫苗的创制奠定重要基础，同时也可为其他家禽病毒的基因工程重组疫苗提供载体。