一株粘质沙雷氏菌及其在联产灵菌红素、几丁质酶和脂肪酶中的应用

本发明属于生物工程，具体涉及一株粘质沙雷氏菌及其在联产灵菌红素、几丁质酶和脂肪酶中的应用。

背景技术：

1、灵菌红素(prodigiosins，pg)是由放线菌、细菌产生的一类次级代谢产物，其属于脂溶性色素，因其骨架含有一个共同的吡咯和双吡咯亚甲基的环状结构骨架，几乎不溶于水，易溶于醇类及丙酮、吡啶等极性较大的溶剂，不溶于石油醚、乙醚、乙酸乙酯等极性较小的溶剂。研究表明，pg除具有抗菌、抗肿瘤、免疫抑制等多种生理活性外，还有营养保健和天然染料的功能，应用于医药和纺织工业具有独特优势。

2、

3、几丁质，又称甲壳素，是一种提取自海洋甲壳类动物壳中的多糖物质，在自然界的储量丰富，仅次于纤维素，其降解产物几丁寡糖的生理生化功能越来越引起人们的注意。但是工业上制备几丁寡糖步骤多，成本高。因此，使用几丁质酶来生物降解几丁质生产几丁寡糖是一条切实可行的途径。另一方面，几丁质是昆虫的围食膜、植物病原线虫卵壳和植物真菌细胞壁的重要组成部分，其主要是作为支撑身体结构的骨架，对机体起到保护作用。几丁质酶在植物病虫害防治方面有着广阔的应用前景。

4、脂肪酶，即三酰基甘油酰基水解酶，是一种能够催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应的水解酶。脂肪酶的来源十分广泛，存在于部分微生物、动物的胰脏和油料作物的种子中。脂肪酶在食品加工、医药、化妆品、生物柴油等方面具有广泛的应用前景。在食品加工中，脂肪酶能够改善糕点、肉制品和乳制品的口感和质地，提高食品的质量，减少生产成本和污染。在其他领域中，脂肪酶可以用于制备药物中间体、化妆品原料等，还可以用于生物柴油的生产，具有很高的应用价值和市场前景。

5、目前，灵菌红素、几丁质酶和脂肪酶的制备需要不同的菌株单独发酵得到，s.marcescens soce 001经发酵优化得到灵菌红素浓度为2.468g/l，bacillusthuringiensis bt028经发酵优化得到几丁质酶酶活为10.48u/ml，moesziomyces aphidis经发酵优化得到脂肪酶酶活为83.14u/ml，此类菌株所产单一产物的产率较低，且花费时间长，成本较高，效率低。

6、目前未见有使用粘质沙雷氏菌发酵联产灵菌红素、几丁质酶和脂肪酶的相关报道。

技术实现思路

1、发明目的：本发明所要解决的问题是提供一株具有灵菌红素、几丁质酶和脂肪酶发酵能力的的粘质沙雷氏菌。

2、本发明还要解决的技术问题是提供上述粘质沙雷氏菌在联产灵菌红素、几丁质酶和脂肪酶中的应用。

3、技术方案：为解决上述问题，本发明采取的技术方案如下：

4、本发明筛选得到一株粘质沙雷氏菌，分类命名为serratia marcescens lt-7，已保藏于“中国典型培养物保藏中心”(简称cctcc)，保藏地址：湖北省武汉市，洪山区八一路，武汉大学山国典型培养物保藏中心，邮编：430072，保藏编号为cctcc no:m20231646，保藏日期为2023年9月7日。以下内容均以此菌株作为生产菌株。

5、所述菌株具有下述性质：

6、菌株的16s rdna基因的核苷酸序列长度为1471bp，其基因序列如seq id no：1所示。将所测序列从gene bank数据库中使用blast程序进行同源性比较，构建16srdna全序列为基础的系统发育树。结果表明：菌株与粘质沙雷氏菌s.marcescens strain jw-cz2达到100％同源性。根据菌株形态学观察和生理生化实验分析结果认定本发明所使用的是粘质沙雷氏菌，命名为粘质沙雷氏菌s.marcescens lt-7。

7、上述粘质沙雷氏菌s.marcescens lt-7联产灵菌红素、几丁质酶和脂肪酶应用也在本发明的保护范围之内。将粘质沙雷氏菌s.marcescens lt-7接种于发酵培养基中进行好氧培养，制备灵菌红素、几丁质酶和脂肪酶。

8、具体的应用方法为，将粘质沙雷氏菌s.marcescens lt-7接种于斜面固体培养基，然后转接到种子培养基，最后接种于发酵培养基中进行好氧培养，发酵液中富含灵菌红素、几丁质酶和脂肪酶。

9、本发明所述粘质沙雷氏菌s.marcescens lt-7及其在制备灵菌红素、几丁质酶和脂肪酶中的应用，依次包括以下步骤：

10、1.培养基配制：

11、(1a)斜面培养基成分为：胰蛋白胨10g/l，酵母浸粉3g/l，氯化钠10g/l，琼脂粉20g/l，溶剂为水，ph值6.0～7.0，优选为6.8。

12、(1b)液体种子培养基成分为：胰蛋白胨10g/l，蔗糖10g/l，氯化钙6g/l，溶剂为水，ph值6.0～7.0，优选为6.8。

13、(1c)固体种子培养基成分为：胰蛋白胨10g/l，蔗糖10g/l，氯化钙6g/l，琼脂粉20g/l，溶剂为水，ph值6.0～7.0，优选为6.8。

14、(1d)发酵培养基成分为：碳源20～30g/l，氮源10～15g/l，金属盐1～5g/l，黄豆粉1～3g/l，ph值6.0～7.0，优选为6.8，溶剂为水。

15、其中，所述碳源为蔗糖、甘油、甘露糖醇、麦芽糖、葡萄糖、糖蜜中的任意一种或几种的组合；优选糖蜜，所述糖蜜的添加量优选为20g/l；

16、所述氮源为牛肉膏、胰蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、花生粉、黄豆粉、小麦胚芽粉、酵母粉、蛋白胨的任意一种或几种的组合，优选胰蛋白胨，所述胰蛋白胨的添加量优选为12g/l；

17、所述金属盐为氯化钙、硫酸锌、硫酸亚铁、氯化锰、硫酸镁、氯化钠中的一种或几种的组合，优选氯化钙，所述氯化钙的添加量优选为3g/l；

18、所述黄豆粉的添加量优选3g/l；

19、最优选的发酵培养基包含如下组分：糖蜜20g/l，胰蛋白胨12g/l，氯化钙3g/l，糖蜜20g/l，黄豆粉3g/l，溶剂为水，利用碳酸氢钠将发酵液初始ph调至6.8。

20、2.菌种选择：

21、已保藏菌株粘质沙雷氏菌s.marcescens lt-7。

22、3.菌种活化：

23、将粘质沙雷氏菌s.marcescens lt-7菌种接种于斜面培养基，20～30℃静置培养16～36h，再次挑取单菌落划线到普通固体培养基上，20～30℃培养16～36h，得到活化菌种备用。

24、4.种子液制备：

25、取步骤3中活化好的菌种，无菌条件下接种1环于种子液的摇瓶中，置于转速为200rpm的摇床上，温度为24～30℃避光培养12h，得到发酵种子液。

26、5.摇瓶发酵培养：

27、将步骤3中发酵种子液在无菌条件下以3％(v/v)的接种量，将种子液接种于发酵培养基摇瓶中，置于转速为200rpm的摇床上，避光24～32℃培养36～48h；当发酵液中灵菌红素、几丁质酶和脂肪酶浓度基本不再上升时，发酵停止。

28、6.发酵罐发酵培养：

29、将步骤4中发酵种子液在无菌条件下以8％(v/v)的接种量，将种子液接种于发酵罐中，装液量为3l/5l，转速为200～500rpm，通气比为0.8～1.0vvm，培养温度为24～32℃，初始ph为6.0～7.0，培养24～72h，当发酵液中灵菌红素、几丁质酶和脂肪酶浓度基本不再上升时，发酵停止。

30、7.灵菌红素的提取

31、(7a)粗品制备

32、取步骤5或步骤6中的粘质沙雷氏菌s.marcescens lt-7发酵液于9000rpm条件下离心，取沉淀菌体，加入甲醇(ph 3)溶液超声辅助浸提20min后浸提过夜，得到菌体处理液，将其浓缩至膏状，加入浓缩液2倍体积的乙酸乙酯溶解，经过滤去除沉淀，上清液浓缩冷冻干燥得到灵菌红素粗品。

33、(7b)分离

34、将步骤(7a)所得的灵菌红素粗品溶解于25倍体积丙酮中待用。采用硅胶层析柱分离提纯灵菌红素。流动相采用石油醚：丙酮(5：2)，硅胶采用200-300目，收集各组分过0.22μm的滤膜置于进样瓶中待用。样品采用高效液相色谱法检测，色谱柱：sepax c18；流动相：乙腈：乙酸铵(85：15)；流速：1.00ml/min；进样量：10μl；柱温：30℃。

35、(7c)提纯

36、根据步骤(7b)所得液相色谱图分析，将含有灵菌红素的组分混合浓缩、冷冻干燥后得到灵菌红素粉末。

37、8.灵菌红素的鉴定

38、采用高效液相色谱仪、红外光谱仪和核磁共振仪来鉴定粘质沙雷氏菌s.marcescens lt-7发酵产物。

39、取步骤7所得灵菌红素粉末100mg溶于100ml甲醇，调节ph至3，得到灵菌红素甲醇溶液其液相色谱结果如图3所示。在相同色谱条件下，该物质与灵菌红素标准品对比，在同一处均有吸收峰出现，说明发酵液中含有灵菌红素。

40、取步骤7所得灵菌红素粉末0.2mg与少量kbr研磨压片制样，然后用红外光谱仪测定样品的红外图谱，扫描范围4000～400cm～1，结果如图4所示。以cd3cl为溶剂，对粘质沙雷氏菌s.marcescens lt-7发酵提纯产物进行nmr1 h和nmr 13c检测，结果如图5和图6所示。

41、9.灵菌红素含量测定

42、(9a)标准曲线的绘制

43、精密称取干燥恒重的灵菌红素标准品，在酸性(ph 3)条件下，配置成0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mg/ml的标准甲醇溶液，使用酶联免疫检测仪测定535nm处的吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程，如图(2a)所示，并依据该标准曲线计算灵菌红素的含量。

44、(9b)发酵液中灵菌红素含量的测定

45、在酸性(ph 3)条件下，发酵液中加入甲醇浸提20min，将浸提液于9000rpm离心3min；取离心上清液，使用酶联免疫检测仪测定535nm处的吸光度，每个离心管重复测三次取平均值，导出数据，参照灵菌红素标准曲线，求出灵菌红素的含量。

46、10.几丁质酶含量测定

47、(10a)标准曲线的绘制

48、(10a-1)标准液的配置

49、精密称取n-乙酰基-d-氨基葡萄糖粉末，加入一定量的蒸馏水配置成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5μmol的标准液。

50、(10a-2)反应液的配置

51、取(10a-1)中的标准液加入等量二硝基水杨酸(dns)试剂配置成不同含量的n-乙酰基-d-氨基葡萄糖反应液。

52、(10a-3)测定

53、混匀后沸水浴10min。冷却后于535nm处测吸光值，以只加dns的0号试管调零，每个试管重复测三次取平均值，导出数据，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程，如图(2b)所示，并依据该标准曲线计算n-乙酰基-d-氨基葡萄糖的含量。

54、(10b)发酵液中几丁质酶的测定

55、(10b-1)取粘质沙雷氏菌s.marcescens lt-7发酵液于9000rpm条件下离心，取离心后的发酵上清液分两组处理：第一组取1ml上清液沸水处理15min，第二组取1ml发酵液不做处理；

56、(10b-2)取步骤(10b-2)中第一组处理后的发酵上清液1ml，加入500μl配置好的2％胶体几丁质(ph＝6)、500μlpbs溶液(50mm，ph 7.0～7.4)混匀；取第二组作为第一组发酵液的空白对照；

57、(10b-3)混合均匀后，步骤(10b-2)中的发酵液经过37℃水浴反应1h，10000rpm离心5min，分别取1ml上清液，加入相同体积dns溶液沸水浴10min，稀释10倍后测定溶液在波长535nm处的吸光值，参照n-乙酰基-d-氨基葡萄糖标准曲线，求出几丁质酶的酶活。菌株发酵液上清液的几丁质酶酶活(e)＝第二组发酵上清液的酶活(e2)-第一组发酵上清液的酶活(e1)。

58、11.脂肪酶酶含量测定

59、(11a)粗酶液的制备

60、取一定体积的摇瓶培养后的发酵液，利用高速冷冻离心机将菌液在1000×4℃条件下离心5min，将得到得含有酶的上清液作为粗酶液进行后续实验。

61、(11b)酶活力的测定方法

62、以对硝基苯脂肪酸酯为底物，测定脂肪酶活力。标准测定反应混合物含有50mmol/l磷酸缓冲液(280μl，ph 7)，30mmol/l p-npa(10μl)，粗酶液(10μl)。于40℃下进行实验反应5min后，加入100μl 0.5mol/l的na2co3(500μl)，终止反应实验。将酶活的单位(u)定义为每分钟催化p-npa产生1μmol对硝基苯酚(405nm)所需的酶量。

63、有益效果：

64、本发明筛选得到一株联产灵菌红素、几丁质酶和脂肪酶的菌株，该菌株能够以廉价的糖蜜为碳源发酵合成灵菌红素，同时可以联产几丁质酶和脂肪酶，培养基中可积累灵菌红素的最高浓度为20.70g/l，几丁质酶的最高酶活为49.78u/ml，脂肪酶的最高酶活为86.92u/ml。该方法不仅生产成本低，而且操作简单，这对于灵菌红素、几丁质酶和脂肪酶的生产和拓展应用具有十分重要的意义。