一株耐受低pH和高浓度尿素的枯草芽胞杆菌

：本发明涉及一株敲除枯草芽胞杆菌168非必需基因大片段获得的5号菌株，可以用于底盘改造、耐受性提升、菌株性能优化、代谢工程等领域，属于合成生物学。

背景技术

0、背景技术：

1、枯草芽胞杆菌是典型的模式工业微生物，其被认定为生物安全(gras)的宿主菌株，在多个领域包括蛋白酶制剂、精细化学品、营养品以及药品等方面被广泛的应用。虽然枯草芽胞杆菌已有良好的应用前景，但在生产应用中非必需基因的表达以及非目标化学品的积累造成了生产应用中前体物质流失、代谢流分散以及旁路途径表达从而导致资源与能源的浪费。因此，底盘细胞中部分非必需基因的冗余是工业应用的限制瓶颈之一。只有实现枯草底盘细胞资源的重新分配，提高对底物与能量的利用，敲除枯草芽胞杆菌部分非必需基因，实现对不同产物代谢流的最优化，才能最终获得高效的枯草底盘细胞。

2、非必需基因的敲除方法主要包括定点编辑和随机诱变两种方法。随机诱变法主要通过化学或者物理等手段使基因组发生突变，但其突变位点以及删除的大小都不确定，故而较少在敲除库构建中使用。定点编辑，主要包括基于cre/loxp的同源重组以及crispr的基因编辑技术，可实现一次删除130kb左右的基因组，更适合用于非必需基因的精简。其中，近年来开发的基于crispr/cas9的基因组编辑技术仅需针对不同位点设计n20以及修复模版，即可用于基因编辑，更加的便捷高效。因此，已经被广泛地应用于敲除库的构建中。

3、确定敲除区域是非必需基因敲除库建立的重要环节，对于敲除库的功能以及潜在应用至关重要。虽然理论上非必需基因都能被单个敲除，但是同时删除多个非必需基因受到菌株生长代谢的限制，并非所有非必需基因可同时删除。因此，基于转录组学分析，结合基因功能信息和比较基因组学分析等方法，确定合理的基因删除位点，通过靶向设计确定高效的编辑位点，优化长片段敲除的编辑方法，从而构建出可预期的大片段敲除的底盘细胞。

4、基于大片段区域敲除后的菌株，其生理特征及代谢有所区别，该枯草可用于菌株性能的筛选，包括大宗化学品耐受性筛选，逆境驯化；枯草芽胞杆菌必需基因以及影响菌株生长代谢基因的鉴定；蛋白质表达平台构建，包括可以提升蛋白质、工业酶等的表达和活性；微生物底盘改造，包括蛋白分泌途径改造、代谢物合成途径改造、基因组精简等；以及代谢工程的应用，比如大宗化学品、食品添加剂、天然产物高产菌株的筛选及构建。

技术实现思路

0、技术实现要素：

1、本发明的目的在于提供一株耐受性高的枯草芽胞杆菌，用于菌株性能筛选，蛋白质表达平台构建，微生物底盘改造，代谢工程等方面。

2、本发明的发明人在研究中对枯草芽胞杆菌168菌株的转录组进行分析，结合基因功能信息和比较基因组学分析等方法，对枯草芽胞杆菌168菌株进行大片段敲除。同时优化crispr/cas9的基因编辑方法，提供一种高效的构建大片段敲除系统的方法，所有表达元件均包含在一个骨架上，通过设计不同的sgrna表达框，避免重复片段的同源重组，一次性引入多个n20，并且优化修复模版，从而提高大片段敲除的效率。此方法能够实现在4天内大片段的敲除，加速大片段编辑的速度，且该方法简单、易于操作。

3、本发明提供的技术方案之一，是一株胁迫耐受性高的枯草芽胞杆菌，所述菌株是以枯草芽胞杆菌(bacillus subtilis)168菌株为出发菌株，对基因组上如序列表seq idno.1所示的序列进行敲除获得的，敲除后的重组菌命名为枯草芽胞杆菌5号菌株(即，5号菌株，或δ5菌株)；

4、进一步地，所述敲除序列位于基因组上第608,246到634,651位；所述敲除序列在基因组上的位置编号参考https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/gcf_000009045.1/，枯草芽胞杆菌168菌株全基因组的genbank登录号为：nc_000964.3。

5、本发明提供的技术方案之二，是枯草芽胞杆菌5号菌株的应用，特别是在耐酸底盘菌构建、氨基酸生产、乳酸生产、尿素耐受底盘菌构建、脲酶生产、尿素降解等中的应用。

6、有益效果：

7、本发明对所构建的非必需基因敲除菌进行性能评估，包括敲除菌株在lb、ph胁迫以及尿素胁迫等条件下的生长进行测定，发现敲除菌株具有良好的胁迫耐受性。

8、其中，对从dinb到ydhuc(seq id no.1所示)的全长26.4kb的大片段进行敲除获得的枯草芽胞杆菌5号菌株，能够解决野生型枯草芽胞杆菌168菌株在ph5以下及高浓度尿素条件下生长状态恶劣的问题。(1)ph5条件下，野生型枯草芽胞杆菌168菌株28h测得od600为0.45，而5号菌株在生长12h时od值达到了1.5左右。(2)进行大片段敲除后，5号菌株的尿素耐受性得到了显著提高，在60g/l尿素的条件下，28h时od达到了1.7左右，展示出良好的生长性能，其比生长速率分别为0.130,显著高于野生型168的0.065，因此有潜力作为尿素降解底盘菌进行进一步应用。

技术特征：

1.一株耐受性高的枯草芽胞杆菌，其特征在于，所述菌株是以枯草芽胞杆菌(bacillussubtilis)168为出发菌株，对基因组上由从dinb到ydhuc的基因片段进行敲除获得的。

2.如权利要求1所述的一株耐受性高的枯草芽胞杆菌，其特征在于，所述菌株是以枯草芽胞杆菌(bacillus subtilis)168为出发菌株，对基因组上seq id no.1所示的序列进行敲除获得的。

3.权利要求1或2所述耐受性高的枯草芽胞杆菌的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，是在ph耐受或尿素耐受底盘菌构建中的应用。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，是在氨基酸生产、乳酸生产、脲酶生产、尿素降解等中的应用。

技术总结本发明涉及一株敲除枯草芽胞杆菌168非必需基因大片段获得的5号菌株，可以用于底盘菌改造、耐受性提升、菌株性能优化、代谢工程等领域，属于合成生物学技术领域。所述菌株是通过对枯草芽胞杆菌168基因组上第608,246到634,651位的序列进行敲除获得的，能够显著提高在低pH及高浓度尿素条件下的生长能力，可应用于耐酸底盘菌构建、尿素耐受底盘菌构建、氨基酸生产、乳酸生产、脲酶生产、尿素降解等领域。技术研发人员：霍毅欣,孙丽超,郭淑元,夏燕受保护的技术使用者：北京理工大学技术研发日：技术公布日：2024/9/12