一株产糖化酶米根霉及在食醋醋醅中的应用

本发明属于微生物，具体涉及一株产糖化酶米根霉及在食醋醋醅中的应用。

背景技术：

1、食醋是一类在世界范围内广泛食用的酸性饮品或调味剂，以淀粉、含糖物料、食用酒精等作为单一或混合原料，经由微生物发酵形成。固态发酵分为熟料发酵以及固态生料发酵，较熟料发酵相比，固态生料发酵周期长、出醋率低，但工艺简单、能耗低，生产成本远低于熟料发酵。固态发酵既是我国的传统制醋工艺，也是我国现行主流的食醋发酵方法。我国固态发酵食醋代表包括：山西老陈醋、四川麸醋等。四川麸醋以中药曲、麸皮、小麦、高粱等作为主要原料，使生产得到的保宁醋带有独特的药草香味。食醋的固态生料发酵是一个糖化、酒化、醋化等阶段同池、同步进行的多边发酵过程；但这种自然发酵方式淀粉利用率低，进而降低了成品得率，此外，该工艺无法实现连续化作业，标准化程度低，实际生产中多依靠经验判断，可控性差，致使产品质量不稳定。因此，如何在保留固态发酵食醋风味品质的基础上改善其酿造工艺，缩短生产周期，提高原料利用率以及出醋率，降低食醋生产成本、提升食醋品质，成为固态生料制醋工业亟待解决的问题。

2、曲霉属与根霉属被公认为产淀粉酶活性最高的菌种，是酿酒与制醋行业的主要糖化菌。曲霉属中的黑曲霉能产生糖化酶、液化酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等丰富酶类，在食醋酿造工业中应用较普遍，其工业菌种包括乌沙米根霉、黑曲霉、甘薯曲霉等，麻成金等在湘西原香醋醅中筛选出一株高产糖化酶的优势黑曲霉，其糖化力课达到1798 u/g；王佳丽等从山西老陈醋大曲中筛选得到一株高产糖化酶的黑曲霉，对其进行产酶条件的优化，优化后的菌株产糖化酶活力为892.98u/ml；华根霉、米根霉在根霉属中产糖化酶、蛋白酶能力较好，且具有一定的酒化能力，能边糖化边发酵，同时可产生乳酸等有机酸，因此被较多地应用于酿造行业。

技术实现思路

1、本发明涉及一株产糖化酶米根霉及在食醋醋醅中的应用。

2、产糖化酶霉菌的初筛：产糖化酶霉菌的初筛采用透明圈法。大曲中分离纯化得到的霉菌点接于淀粉酶筛选培养基，于28℃培养3 d，用卢戈氏碘液均匀喷洒于选择培养基，染色5 min，观察透明圈，测定菌落直径与透明圈直径，计算水解圈直径与菌落直径的比值，筛选比值较大的菌株，将其点接划线分离、纯化后，进行保种，用于复筛。同时以糖化酶溶液作为阳性对照，以空白培养基作为阴性对照。

3、产糖化酶霉菌的复筛：准确称取麸皮10 g于250 ml三角瓶中，加入9 g蒸馏水，搅拌均匀，蒸料灭菌（121℃）20min，摇动三角瓶使料块分散，待麸皮冷却备用，将复筛霉菌于28℃培养4 d，将斜面上的霉菌孢子洗脱至5 ml孢子洗脱液中，取500μl孢子悬液于麸皮培养基中，混合均匀后于28℃培养72 h，每株菌做3次平行。

4、初筛霉菌糖化力的测定：糖化力的测定参照qb/t 4257-2011《酿酒大曲通用分析方法》。具体内容如下：样液的制备：称取6g左右的曲样（精确至0.001g），加入20ml乙酸-乙酸钠缓冲溶液（ph值为4.6）与适量蒸馏水，定容至250ml；将上述烧杯置于35℃恒温水浴中，以140 r/min的速度振荡保温1 h，过滤，收集滤液备用。

5、样液的测定：于50 ml离心管内依次加入25.0 ml可溶性淀粉溶液和5.0 ml备用滤液，摇匀，置于35℃恒温水浴中，准确计时，糖化1 h，加入1 ml naoh溶液（20%）终止糖化反应，吸取5.0 ml糖化液于盛有费林溶液甲、乙液各5.0 ml的150 ml锥形瓶中，加水10 ml，用葡萄糖标准溶液（2.5g/l）滴定，操作同空白组的测定，记录葡萄糖标准溶液的消耗体积。根据标准列式计算，以蒸馏水替换糖化液为空白对照。

6、初筛霉菌生淀粉糖化力的测定：用小麦淀粉替代可溶性淀粉，其余测定步骤同糖化力，选择糖化力与生淀粉糖化力相对较高的霉菌作为强化菌株。

7、形态学观察：将目的菌株点种于pda培养基平板，于28℃培养3 d后观察菌落特征；菌落特征和菌体形态参照《真菌鉴定手册》进行鉴定。

8、细胞形态观察：采用乳酸石炭酸棉蓝浸片法。将乳酸石炭酸棉蓝染液滴加一滴在洁净载玻片上，用接种环挑取少量带有孢子的菌丝，置于染液中，用接种环将染液中的孢子分散开，取一块盖玻片，将盖玻片一侧与菌液接触，然后缓慢将盖玻片放下，避免产生气泡，将制好的霉菌制片于显微镜下观察。

9、分子生物学鉴定：dna提取采用试剂盒法，以提取的菌落dna为模板，its 1、its 4为引物，进行pcr扩增，将序列与ncbi中已有的its序列进行相似性比较分析，选取与供试菌株相似度高的序列，构建系统进化树。

10、产糖化酶霉菌经过初筛和复筛后得到菌株sfm-1，其疑似根霉，糖化力水平最高，为2524.15mg/g·h，生淀粉糖化力适中，为199.43 mg/g·h，选取米根霉sfm-1为后续试验菌株（图1）。

11、形态学观察;霉菌sfm-1菌落形态特征如图2，菌落不透明，棉絮状，菌落边缘丝状。

12、菌株sfm-1 its序列如下：

13、 cggaaggatcattaattatgttaaagcgccttaccttagggtttcctctg

14、 gggtaagtgattgcttctacactgtgaaaatttggctgagagactcagac

15、 tggtcatgggtagacctatctggggtttgatcgatgccactcctggtttc

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17、 aaaaaacaacttttaacaatggatctcttggttctcgcatcgatgaagaa

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22、 tgtctggcttgctaggcaggaatattacgctggtctcaggatcttttttt

23、 ttggttcgcccaggaagtaaagtacaagagtataatccagtaactttcaa

24、 actatgatctgaagtcaggtgggattacccgctgaacttaagcatatc

25、 对产糖化酶菌株进行pcr扩增，测序结果经ncbi进行blast比对，菌株sfm-1与 rhizopus oryzae strainsfr-7（mt 540020.1）相似性达到100%，结合形态学结果判定sfm-1为米根霉；将其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心( cgmcc )，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2020年11月26日，保藏编号：cgmcc no.21029。