一种可促使细胞膜固定蛋白分泌的融合蛋白、重组疫苗及应用的制作方法

本发明涉及生物医药，特别是体液免疫领域，具体涉及一种包含fcγrii胞内段以及nedd4 ww结构域的体液免疫疫苗分子架构及其应用。

背景技术：

1、体液免疫（humoral immunity）是免疫系统的重要组成部分，主要由b细胞介导调控。当机体受到病原体（如细菌、病毒）入侵时，抗原被b细胞表面的受体（bcr）识别、内化，在细胞内降解成肽段呈递给辅助t细胞。活化的辅助t细胞向b细胞提供共刺激信号，促进b细胞增殖分化产生大量针对该抗原的抗体。这些抗体可通过中和、沉淀、激活补体、操纵杀伤细胞等作用清除病原体。同时，少量b细胞分化为记忆b细胞，为机体提供长期免疫保护。

2、体液免疫疫苗是指能够诱导机体产生体液免疫应答的疫苗，是预防性疫苗的主要类型。传统的体液免疫疫苗包括灭活疫苗、减毒活疫苗和重组蛋白疫苗等，通过疫苗中的抗原分子刺激机体产生针对性抗体。近年来，核酸疫苗作为一种新型体液免疫疫苗展现出巨大的发展潜力。

3、核酸疫苗是指携带病毒抗原基因的dna或mrna分子疫苗。这些核酸分子在体内表达后，产生的抗原蛋白可诱发体液和细胞免疫应答。与传统疫苗相比，核酸疫苗具有安全性好、易于大规模制备、可快速针对新型病毒设计等优势，在病原体感染类疾病的预防和治疗过程中具有广阔的应用前景。

4、外源膜蛋白和分泌蛋白是重要的体液免疫抗原种类。但常规的体液免疫核酸疫苗往往难以高效表达这些靶标蛋白，且靶标蛋白无法充分呈现到细胞外，被b细胞受体有效识别的概率较低，因此只能诱导机体产生较低水平的抗体，免疫保护作用有限。因此，提高体液免疫抗原的表达水平，并将其有效呈递到b细胞富集的免疫器官或生发中心，是提升此类疫苗免疫原性的关键一步。

5、外泌体（exosomes）是活细胞产生并分泌到胞外的一种囊泡（extracellularvesicles，evs），其大小为30-160nm，具有和细胞膜一样双层膜结构，参与细胞间的分子传递。几乎所有细胞都可以产生外泌体，目前已有研究利用外泌体的特性进行人工改造，使外泌体能够应用于药物递送领域。例如，现有技术中国专利cn115708871a（公开日2023-02-24）和cn115737796a（2023-03-07），公开了一种将抗原呈现到evs表面的方法。该方法将抗原融合到cd63蛋白的胞外域中，使含有cd63的evs出芽时携带抗原，诱导机体产生免疫反应。但由于携带cd63的evs大部分定位于细胞内，能够分泌到胞外的数量有限，因而诱导的体液免疫并非最佳水平。此外，该方法将抗原融合到cd63的两个跨膜区之间，可能会影响抗原蛋白的构象，阻碍构象表位发挥作用。

6、arrestin domain containing 1（arrdc1）介导的蛋白质内吞运输能够形成微囊泡，通常与g蛋白偶联受体内化相关，在调控多种膜蛋白如受体、转运体及离子通道等的内化循环中发挥作用。目前已有研究利用该蛋白产生重组外泌体，如美国专利us11730823b2公开了一种方法，能够将rna载入由arrdc1介导的微囊泡（armm）中。该方法将rna结合蛋白融合到arrdc1蛋白的c端，从而将特定的rna载入armm中，成为rna药物载体。由于arrdc1分子量较大，且主要和细胞内吞、内化途径相关，已被许多研究证明不利于抗原在膜表面的呈现，因而无法应用于体液免疫疫苗开发。

7、部分e3泛素蛋白连接酶nedd4家族成员蛋白的c端含有ww结构域，由ww1、ww2、ww3、ww4四个元件组成。nedd4是最初在早期小鼠胚胎中枢神经系统中发现高度表达的一种基因。随后，nedd4类似蛋白家族在人类被确定包括7个成员。nedd4和nedd4l蛋白包括多种功能结构域，包括钙依赖的磷脂和膜结合结构域（c2 domain），两种到四种蛋白结合结构域(ww结构域)，以及一种e3泛素-蛋白连接酶结构域（hect结构域）。专利us20190374506a1（公开日2019-12-12）公开了一种治疗癌症的方法,该方法包括向患有癌症的受试者施用有效量的抑制神经前体细胞表达的发育下调蛋白4（nedd4）的表达或活性的药剂，以及抑制 ww结构域蛋白1（wwp1）的表达或活性的试剂。低亲和力免疫球蛋白γ fc区受体ii（fcγrii）是一种在人体细胞表面广泛表达的受体，属于免疫球蛋白g（igg）fc区受体家族，主要负责调节免疫细胞的活化和抑制。fcγrii是一种跨膜蛋白，由细胞外区域、跨膜区和细胞内区域组成。已有研究将其细胞外区域与靶蛋白融合，如专利wo2022158836a1（公开日2022-07-28）公开了一种重组外泌体，包含与靶蛋白或肽可融合的fc受体胞外段或其部分，其中fc受体包括fcγrii。专利cn116782932a（公开日2023-09-19）公开了一种胞外囊泡的组合物，包含融合fc受体胞外段的靶点蛋白，其中fc受体包括fcγrii。但现有技术尚未有研究公开fcγrii胞内段和外泌体相关的内容。

8、因此，本领域仍然亟需一种更有利于细胞膜固定蛋白分泌的新的融合抗原架构，以及相应构建的重组疫苗，在不破坏体液免疫抗原构象的前提下，达到更优的促进体液免疫抗原表达、分泌的能力，提高体液免疫水平的效果。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种体液免疫疫苗架构融合蛋白、重组疫苗等。本发明的融合蛋白包含，低亲和力免疫球蛋白γ fc区受体ii（fcγrii）的胞内段，e3泛素蛋白连接酶nedd4家族成员蛋白的ww结构域（ww domain），和/或一种或多种抗原，和/或一种或多种跨膜区。本发明提供了一种全新的重组疫苗分子架构，具备更优的促进体液免疫抗原表达、分泌的能力，提高体液免疫水平的效果，为重组疫苗的设计方案提供了新思路和新方法，可广泛的用于体液免疫疫苗领域。本发明还提供相应的重组核酸、基因表达盒、载体、宿主细胞、药物组合物、疫苗、制药用途、应用方法等。

2、本发明的一方面提供一种融合蛋白，其特征在于，包含以下元件：

3、（a）低亲和力免疫球蛋白γ fc区受体ii（fcγrii）的胞内段；和

4、（b）e3泛素蛋白连接酶nedd4家族成员蛋白的ww结构域（ww domain）。

5、进一步地，其特征在于，所述融合蛋白还包含（c）一种或多种抗原；优选地，所述抗原为体液免疫蛋白的完整序列或部分含有体液免疫表位的序列；更优选地，所述体液免疫蛋白为病原体的膜蛋白或分泌蛋白；最优选地，所述病原体的膜蛋白或分泌蛋白为禽流感的ha蛋白或bvdv（牛病毒性腹泻病毒）的e2蛋白的部分或全长序列。

6、进一步地，其特征在于，所述抗原为禽流感h9n2的ha蛋白，bvdv（牛病毒性腹泻病毒）的e2蛋白，或禽流感h1n1的ha蛋白；优选地，所述禽流感h9n2的ha蛋白的氨基酸序列如seq id no:5所示，所述bvdv的e2蛋白的氨基酸序列如seq id no:6所示，所述禽流感h1n1的ha蛋白的氨基酸序列如seq id no:7所示。

7、进一步地，其特征在于，所述融合蛋白还包含（d）一种或多种跨膜区；优选地，所述跨膜区可以是抗原序列自有跨膜基序，或截选自其他膜蛋白的跨膜基序；更优选地，所述截选自其他膜蛋白的跨膜基序来自于任意物种的cd80蛋白；最优选地，所述cd80蛋白的跨膜基序的氨基酸序列如seq id no:15所示，所述自有跨膜基序的氨基酸序列如seq id no:13所示。

8、进一步地，其特征在于，fcγrii的胞内段可以是细胞质区域的全长或部分序列；优选地，所述fcγrii的胞内段来源于小鼠或豚鼠或人；更优选地，来源于小鼠的fcγrii的胞内段的氨基酸序列如seq id no: 3所示，或者来源于豚鼠的fcγrii的胞内段的氨基酸序列如seq id no: 4所示，或者所述fcγrii的胞内段来源于人fcγriia，所述人fcγriia的胞内段氨基酸序列如seq id no: 11所示。

9、进一步地，其特征在于，所述ww domain位于细胞质一侧，其氨基酸序列如seq idno: 2所示。

10、进一步地，其特征在于，构成元件的各部分可以任选地通过接头（linker）序列间隔开；优选地，所述linker序列如seq id no:8或seq id no:9或seq id no:10所示。

11、进一步地，其特征在于，所述融合蛋白从n端至c端依次包含以下元件：

12、（1）所述抗原；优选地，所述抗原为氨基酸序列如seq id no:5所示的禽流感h9n2的ha蛋白，氨基酸序列如seq id no:6所示bvdv的e2蛋白，或氨基酸序列如seq id no:7所示禽流感h1n1的ha蛋白；

13、（2）所述跨膜区；优选地，所述跨膜区包含跨膜基序，所述跨膜基序是抗原序列自有跨膜基序，或是来自于任意物种的cd80蛋白；更优选地，所述cd80蛋白的跨膜基序的氨基酸序列如seq id no:15所示；

14、（3）所述fcγrii的胞内段；优选地，所述fcγrii的胞内段是来源于小鼠的fcγrii的胞内段，其氨基酸序列如seq id no: 3所示，或者是来源于豚鼠的fcγrii的胞内段，其氨基酸序列如seq id no: 4所示。

15、（4）所述ww domain；优选地，所述ww domain的氨基酸序列如seq id no: 2所示。

16、其中，构成（1-（4））元件的各部分可以任选地通过接头（linker）序列间隔开，优选地，所述linker序列如seq id no:8或seq id no:9或seq id no:10所示。

17、进一步地，其特征在于，所述融合蛋白还包含信号肽序列；优选地，所述信号肽序列的氨基酸序列如seq id no:12或seq id no:14所示。

18、进一步地，其特征在于，所述融合蛋白为以下的任一种：

19、（a）从n端到c端包含如下元件：氨基酸序列如seq id no: 5所示的靶标抗原1，氨基酸序列如seq id no:3所示的小鼠fcγrii胞内段，，氨基酸序列如seq id no: 2所示的ww domain；

20、（b）从n端到c端包含如下元件：氨基酸序列如seq id no: 5所示的靶标抗原1，氨基酸序列如seq id no:4所示的豚鼠fcγrii胞内段，氨基酸序列如seq id no: 2所示的wwdomain；

21、（c）氨基酸序列如seq id no:14所示的信号肽，氨基酸序列如seq id no: 6所示的靶标抗原2，氨基酸序列如seq id no:15所示的跨膜区，氨基酸序列如seq id no:4所示的豚鼠fcγrii胞内段，氨基酸序列如seq id no: 2所示的ww domain；

22、所述元件的各部分可以任选地通过接头（linker）序列间隔开。

23、本发明的另一方面提供一种重组核酸分子，其特征在于，编码本发明所述的融合蛋白。

24、本发明的另一方面提供一种重组基因表达盒，其特征在于，包含本发明所述的重组核酸分子。

25、进一步地，其特征在于，所述重组基因表达盒从5’端到3’端依次包含以下元件：启动子，5’ utr，编码信号肽核酸，抗原核酸序列，所述跨膜区，所述fcγrii的胞内段，所述wwdomain，3’ utr，polya尾序列；其中，所述元件的各部分可以任选地通过接头（linker）序列间隔开。

26、本发明的另一方面提供一种重组载体，其特征在于，包含本发明所述重组核酸分子或所述重组基因表达盒。

27、本发明的另一方面提供一种重组宿主细胞，其特征在于，包含本发明所述重组核酸分子、或所述重组基因表达盒、或所述重组载体。

28、本发明的另一方面提供一种药物组合物，其特征在于，包含一种或多种本发明所述融合蛋白，和/或一种或多种本发明所述重组核酸分子，和/或一种或多种本发明所述重组基因表达盒，和/或一种或多种本发明所述重组载体，和/或一种或多种本发明所述重组宿主细胞。

29、进一步地，其特征在于，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。

30、本发明的另一方面提供一种重组疫苗，其特征在于，包含一种或多种本发明所述融合蛋白，和/或一种或多种本发明所述重组核酸分子，和/或一种或多种本发明所述重组基因表达盒，和/或一种或多种本发明所述重组载体，和/或一种或多种本发明所述重组宿主细胞。

31、本发明的另一方面提供一种用于促进融合蛋白以外泌体形式分泌到细胞外的方法，其特征在于，该方法包括向细胞和/或其他生物体施用一种或多种本发明所述融合蛋白，和/或一种或多种本发明所述重组核酸分子，和/或一种或多种本发明所述重组基因表达盒，和/或一种或多种本发明所述重组载体，和/或一种或多种本发明所述重组宿主细胞，和/或一种或多种本发明所述重组疫苗；优选地，所述方法是非治疗和诊断目的的。

32、本发明的另一方面提供一种用于提高体液免疫抗原免疫原性的方法，其特征在于，该方法包括向细胞和/或其他免疫生物体施用一种或多种本发明所述融合蛋白，和/或一种或多种本发明所述重组核酸分子，和/或一种或多种本发明所述重组基因表达盒，和/或一种或多种本发明所述重组载体，和/或一种或多种本发明所述重组宿主细胞，和/或一种或多种本发明所述重组疫苗；优选地，所述方法是非治疗和诊断目的的。

33、本发明的另一方面提供一种用于刺激或活化b细胞的方法，其特征在于，该方法包括向细胞和/或其他免疫生物体施用一种或多种本发明所述融合蛋白，和/或一种或多种本发明所述重组核酸分子，和/或一种或多种本发明所述重组基因表达盒，和/或一种或多种本发明所述重组载体，和/或一种或多种本发明所述重组宿主细胞，和/或一种或多种本发明所述重组疫苗；优选地，所述方法是非治疗和诊断目的的。

34、本发明的另一方面提供一种或多种本发明所述融合蛋白，和/或一种或多种本发明所述重组核酸分子，和/或一种或多种本发明所述重组基因表达盒，和/或一种或多种本发明所述重组载体，和/或一种或多种本发明所述重组宿主细胞，和/或一种或多种本发明所述重组疫苗在以下任一项中的用途：

35、（a）制备用于促进抗原以外泌体形式分泌到细胞外的药物；

36、（b）制备用于提高抗原体液免疫原性的药物；

37、（c）制备用于刺激或激活生物体内b细胞的药物；或

38、（d）制备用于治疗、接种疫苗或生物免疫的药物。

39、进一步地，其特征在于，所述药物为用于预防和/或治疗病毒感染疾病的药物；优选地，所述病毒包括流感病毒，腹泻病毒，孢疹病毒，eb病毒，肝炎病毒，或hpv病毒；更优选地，所述流感病毒为禽流感病毒，所述腹泻病毒为病毒性腹泻病毒；最优选地，所述禽流感病毒为禽流感h9n2或h1n1，所述病毒性腹泻病毒为bvdv。

40、本发明的可促使细胞膜固定蛋白分泌的融合蛋白、重组疫苗等具有如下有益技术效果：

41、1. 本发明所述的融合分子架构的设计思路是将体液免疫抗原以外泌体形式表达、分泌到胞外，其关键元件为低亲和力免疫球蛋白γ fc区受体ii（fcγrii）胞内段和e3泛素蛋白连接酶nedd4家族成员蛋白的ww结构域（ww domain）。本发明的融合分子架构可以使融合蛋白定位到细胞膜上，并以外泌体的形式出芽（budding）分泌到胞外，促使抗原递送到免疫器官或是生发中心，有效增加体液免疫系统识别抗原蛋白的概率，从而提高体液免疫响应水平，为制备高效诱导体液免疫的免疫药物领域提供新技术。

42、2. 本发明所述的融合分子架构中，在抗原和ww domain之间加入fcγrii蛋白的胞内段，fcγrii的胞内段促进形成的囊泡在内质网和高尔基体之间单向运输，有效提高囊泡的出芽率及分泌率。基于本发明的融合分子能够在维持抗原蛋白构象稳定的基础上，大幅增加b细胞识别抗原的几率，从而显著增强抗原靶点的免疫原性，提高体液免疫应答水平。本发明的融合分子架构能够有效改善分泌蛋白和膜蛋白的表达效率，并促使其表达的抗原蛋白呈现在外泌体的表面，分泌到细胞外，从而提高体液免疫响应水平。

43、3. 本发明可作为重组疫苗的通用体液免疫架构，能够在稳定抗原构象的同时，使抗原以外泌体的形式分泌到细胞外，有效提高抗原的体液免疫原性，显著激活体液免疫反应，从而诱导免疫个体产生更高水平的抗原特异性抗体和记忆b细胞。

44、4. 本发明实施例4表明，疫苗a在胞内和上清中的均有表达，证明本发明中的wwdomain具备促使抗原分泌的能力，但表达量和分泌效率较低；疫苗b、疫苗c均在上清中检测到显著表达，证明本发明中的fcγrii元件和ww domain元件组合，能够显著提高蛋白分泌效果，此外，本发明中的fcγrii元件可以来源于不同物种，包括但不限于鼠源、人源等，具有相似的功能。

45、5. 基于本发明的体液免疫疫苗，在体外表达实验中，能够提高抗原蛋白表达水平，并且能够在上清中检测到大量含有抗原蛋白的外泌体，达到技术预期效果。本发明实施例5表明，基于本发明的疫苗e转染的细胞，在上清中检测到目的蛋白显著表达，显著高于细胞内的表达水平，证明本发明架构疫苗能够提高分泌类型抗原的表达及分泌效率，优于常规分泌架构。

46、6. 本发明实施例6表明，本发明的疫苗b所诱导的外泌体形态直径在35-150 nm之间，符合外泌体特征，且靶标蛋白呈簇状分布在外泌体表面。

47、7. 基于本发明的体液免疫疫苗，在体内免疫试验中，能够高效激活体液免疫反应，刺激机体产生高水平的抗原特异性抗体，并产生有效的体液免疫保护，显著优于常规融合分子架构。

48、8. 本发明实施例7表明，用常规膜蛋白架构的mrna疫苗（疫苗f）仅诱导6只小鼠（66.6%）产生较高水平的中和抗体，无法保证全部个体产生有效的体液免疫。而基于本发明的重组核酸疫苗（疫苗g）能够诱导全部个体（100%）产生高水平的中和抗体，证明基于本发明的mrna疫苗能够有效改善mrna疫苗的体液免疫效果。分析产生上述结果的原因，在于本发明架构能够促使抗原以外泌体形式分泌到细胞外，增加了抗原递送到免疫器官或是生发中心的概率，从而提高了b细胞识别抗原的效率，最终诱导高水平的体液免疫。

49、9. 本发明实施例8表明，用基于本发明的mrna疫苗（疫苗g）能诱导蛋鸡产生中和抗体，hi效价为28-210，优于常规分泌疫苗架构的mrna疫苗（疫苗h）所诱导的抗体水平（23-25），证明基于本发明的mrna疫苗不仅在体外细胞实验中能改善蛋白的分泌效果（如实施例5），并且能够有效提高mrna疫苗的体液免疫效果。基于本发明的疫苗不受免疫个体的物种限制，在小鼠和蛋鸡中都能够发挥良好的诱导体液免疫的效果。

50、10. 本发明实施例9表明，单次免疫实验，用常规架构的mrna疫苗（疫苗i）能够诱导小鼠产生中和抗体，hi效价为23-24，而基于本发明的重组核酸疫苗（疫苗j）诱导小鼠产生更高水平的中和抗体，hi效价为24-25。证明基于本发明的mrna疫苗能够在单次免疫后、短期内诱导个体产生更高水平体液免疫反应。

51、11. 基于本发明的体液免疫疫苗适用于多种抗原，且相较于常规融合分子架构，能够在短期内诱导动物个体产生高水平的中和抗体。基于本发明的疫苗，提供了一种全新的重组疫苗分子架构，具备更优的促进体液免疫抗原表达、分泌的能力，提高体液免疫水平的效果，为重组疫苗的设计方案提供了新思路和新方法。